紫外分光光度法测定蛋白质含量
班级: 2010级化学二班 姓名： 马吉元 学号： 一、实验目的
1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比。
标准曲线法：只要绘出以吸光度A 为纵坐标，浓度c 为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
三、仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管
标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）
四、实验操作
1. 启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。 2. 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
3. 将空白放入测量池中，点击START 扫描空白，点击ZERO 校零。 4. 标准曲线的制作。
用吸量管分别吸取1.0 、1.5、 2.0 、2.5 、3.0 mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl 溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A 280，记录所得读数。
5. 样品测定：
取待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定280 nm处的吸光度。平行测定三份。
五、数据处理
1．选择最佳测量波长
由左图可知，蛋白质在224nm
和278nm 左右有吸收峰，且在
224nm 左右处有最大吸收，但是224nm 左右处干扰较大，不能应用。所以最佳测量波长选为
278nm 。
波长
(nm)
2. 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 0.55
0.500.45
0.400.35
由图得标准曲线方程为： 0.300.25 y=0.60333*x+0.0102 0.20
0.15
浓度(mg/mL)
3. 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度
A b s
A b s
由于原样被稀释了一倍，所以未知蛋白样的浓度为： C=2*1.069=2.138 mg/ml S= x −xi RSD=s/x*100%=0.07%
六、注意事项与问题
1. 紫外吸收法测定蛋白质含量，有何缺点及优点？
答：优点：紫外吸收法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定；缺点：设备复杂、昂贵，准确度较差，干扰较大。 2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？
答：核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强；但是蛋白质恰恰相反，在280nm 处的吸收值大于260nm 处的吸收值。利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于蛋白质含量测定的干扰作用。
七、结果讨论
1、做完本次试验我有如下收获：
掌握了紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
学会了TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并测定了未知浓度蛋白质样的浓度。
2、结果分析
从实验数据来看，此次试验结果偏差很小，结果良好。