中国科学 C 辑:生命科学 2008年 第38卷 第10期: 930 ~ 937 www.scichina.com life.scichina.com
专题
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
环境与工业微生物基因组学研究进展
王磊, 刘斌, 周哲敏
南开大学泰达生物技术学院, 天津市功能基因组与生物芯片研究中心, 天津 300457 E-mail: wanglei@nankai.edu.cn
收稿日期: 2008-04-17; 接受日期: 2008-07-26
国家高技术研究发展计划(批准号：2007AA02Z106，2007AA021303和2007AA020703) 和国家自然科学基金(批准号：30530010) 资助项目
摘要 环境微生物是维持生态圈中能量和物质循环的重要因素之一, 在各种污染物和有害物质的降解等方面发挥着重要作用, 在进行能源生产和可再生利用等研究领域具有潜在应用价值. 在超过150种被破译的非致病微生物基因组中, 绝大多数是环境和工业细菌. 随着新一代测序技术的投入使用和元基因组学方法的出现, 国际上的微生物基因组方面的工作进入了高通量和高产出的阶段. 我国已经完成全基因组测序的7株环境细菌中涵盖了嗜高温、嗜酸、耐高压、耐低压等各种极端环境微生物, 研究人员从中发现了众多与环境和工业应用密切相关的代谢途径、遗传功能和生物酶, 目前, 国内多家单位相继启动了元基因组计划, 必将使我国在环境和工业微生物基因组研究领域取得一大批原创成果.
关键词
环境微生物 基因组 元基因组学
1 概论
我们周围的世界栖息和生存着大量肉眼看不见的微生物, 研究发现1克土壤中包含的细菌数量超过一百万种[1], 而其中99.8%的细菌都因为无法在实验室中培养而不为人所知[2], 直至基因组学研究的开展我们才有能力对这些生命有更为深入的了解.
环境微生物指所有存在于土壤、水体、大气和岩层中的微生物, 还包括各种生活在人类、动物和植物中的微生物. 许多微生物可以在各种极端环境中生存. 环境微生物是维持生态圈中能量和物质循环的重要因素, 由于环境细菌代谢的多样性, 许多生命基本元素的自然循环过程都需要细菌的作用. 例如, 醇化作用和氮固定是细菌特有的代谢过程, 因而它们在碳和氮循环中起关键作用. 细菌还能利用许多独特的物质作为氧化剂, 例如
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NO 3
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或者SO 24,
环境微生物有多种用处, 包括对各种污染物(如石油) 和有害物质的生物降解; 研发和生产新型的治疗和预防疾病的产品; 进行能源生产和可再生能源资源的研究(甲烷和氢); 生产化学催化剂、试剂和酶以提高工业生产过程的效率; 对环境中二氧化碳温室气体排放的管理等.
传统测序方法花费大量的资金和时间, 因此人们更多地把精力集中于与人类密切相关的致病菌, 然而也有超过150种非致病微生物的基因组被破译, 其中绝大多数都是环境和工业细菌. 如加州大学洛杉矶分校、加州理工学院和德国雷根斯堡大学的科学家联合对耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum) 的测序工作[5]. P . aerophilum 可在温度高达100℃的海水中生活, 然而, 不同于其进化上的近亲, 它不是纯粹的厌氧型生物, 不能忍受硫的存在. 研究小组完成了对其2.2 M bp基因组的测序, 识别了其中2587个 蛋白编码区, 并最终确定其之所以具有惊人的耐高
以及使
用H 2S 或者各种芳香类物质作为能源[3,4].
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温特点, 是因为它们体内缺少错配修复机制. 这些用来修复DNA 突变的功能是从大肠杆菌到人类都具备的普遍机制, 但在至今测序的6种热棒菌中都未发现其存在. 因此, 这项研究结果增加了热棒菌以一种“突变的生活方式”, 即不断经历未经修正的突变来生活的可能性. 作者在文章中写道, 这些耐高温的原始生物可能是“生物体能够作为永久性突变体存活”的一个极好的实例.
类似的还有氢氧化的光自养细菌Ralstonia eu-tropha , 它具有完整的代谢途径, 可以在无机培养基中生长. R. eutropha H16菌株可以在细胞内产生和储存大量的PHB 和其他高分子聚合物, 这些代谢产物可以用来制造生物可降解塑料, 因而得到了生物工程人员的关注. 2006年德国科学家对R. eutropha全基因组测序的完成使人们对这一工程细菌的应用潜力得到更深的认识.
随着工业的迅猛发展, 水污染日益严重, 而海洋污染更成为令人关注的世界性环境问题. 在海洋各种污染物中, 石油污染是最普遍和严重的一种. Alcan- ivorax borkumensis是一种全球性的海洋微生物, 可以利用石油碳氢化合物作为碳源和能源, 一般在海洋石油未污染区域很难检测到, 一旦有石油污染, 其能够很快的占领石油污染海域, 形成优势菌群. 德国比勒菲尔德大学的科学家对A. borkumensis SK2的基因组进行了研究, 发现该菌基因组有大量的与石油碳氢化合物降解相关的基因, 并且拥有清除海洋营养盐, 特别是有机与无机氮的系统, 能够在油水临界面形成生物膜并产生生物表面活性剂, 多种能力的组合使得A. borkumensis SK2能够在原油污染环境成为优势菌群. 对A. borkumensis SK2的研究为减轻因石油泄露造成的生态污染提供了研究基础.
新一代测序技术的投入使用使基因组测序速度大大提高, 全新的元基因组(metagenomics)方法更是极大地提高了人类所能接触到的微生物范围. 元基因组学是从生境中取得全部微生物的基因组, 并进行系统研究的方法. 目前国际上多项微生物基因组方面的工作都以元基因组学作为重要的研究手段. J. Craig Venter研究所的“巫师Ⅱ”计划(海洋微生物基因组测序计划) 选取全世界79位同行提供的17处海洋表面水体样本, 进行元基因组学研究, 目前已经获
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得630亿碱基数据, 注释得到612万个新的蛋白序列, 以及超过2000个全新的蛋白质家族. 截至2008年3月, 巫师Ⅱ计划公布了126个完整基因组数据, 这些研究成果大大提高了人类对海水中生物多样性的认识[9~12].
白蚁因吞噬木材导致每年几十亿美元的经济损失而恶名远播, 但最近的研究发现它可能为未来的绿色生物燃料生产提供高效的生物化学技术方法. 这种小型昆虫的消化道很可能是个微生物菌群的“金矿”, 有望成为改进木质或废弃物转化为生物燃料过程所需酶的来源. 美国能源部联合基因组研究所JGI 等多家研究中心联合测定了白蚁肠道菌群基因序列, 研究结果发表于2007年11月22日出版的Nature 上[4].
美国能源部还有更庞大的计划. 2007年5月美国能源部联合基因组中心JGI 推出“细菌和古细菌基因组百科全书”(GEBA)计划. 这个百科全书计划旨在系统性地填补细菌和古细菌进化树中的空缺位置, 力图系统性地使用进化树作为筛选测序目标的指导书. 为了测验这个计划的可行性, 美国能源部联合基因组中心JGI 首先选择了100个细菌和古细菌的基因组作为先导.
2 我国环境与工业微生物基因组学研究的
发展
我国的细菌基因组计划起步较晚, 2002年金奇教授课题组[13]完成了第一个细菌全基因组测序(志贺氏菌全基因组). 在前期的发展过程中, 我国也把注意力集中在致病菌基因组中. 然而我国的细菌基因组计划发展很快, 许多具有重要环境意义和工业意义细菌的全基因组计划也陆续提上日程. 我国有广阔的国土面积和丰富的自然地貌资源, 由此形成了独特的环境细菌多样性资源. 科研界利用我国独特的资源优势, 重点对各种适应极端环境的微生物进行研究, 已测序的7株环境细菌中涵盖了嗜高温、耐低温、耐高压、嗜酸等各种极端微生物. 这些适应特殊环境的微生物由于其代谢和遗传的特性, 研究人员能够从中发现许多与众不同的代谢途径、遗传功能和生物酶, 并与工业应用紧密结合.
已完成基因组学研究的嗜热采油芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans) NG80-2[14]和Q1蜡
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状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 中特有烷烃降解酶, 可以在防治石油污染和石油开采中起重要作用. 其中NG80-2是20世纪80年代初在大港油田分离得到的一株具有独特降解重油能力的采油细菌, 南开大学的科学家利用功能基因组学手段, 并结合基因组 学、生物信息学、分子生物学、生物化学等领域的先进方法对NG80-2进行了深入研究, 在世界上首次揭示了微生物降解重油主要组分长链烷烃的代谢途径, 并详尽研究了编码降解长链烷烃的关键蛋白长链烷烃羟化酶基因(ladA ) 的功能. 该成果是石油微生物研究领域的重大突破, 对于石油污染的生物治理和微生物采油技术的革新具有重要科学意义和广泛应用前景. 腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter teng-congensis ) [16]和耐压耐冷菌(Shewanella piezotoler-ans )WP3[17]基因组的测定加深了人类对极端环境中微生物的生理和遗传特征的认识. 极端嗜酸甲烷氧化细菌 (Methylacidiphilum infernorum) 的基因组学研究, 加深了人们对于甲烷利用细菌的种属、生态及遗传多样性的认识, 为进一步控制和利用自然甲烷提供了基础[18,19]. 对酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)基因组的研究及其中与古龙酸代谢密切相关的关键基因的研究, 为维生素C 一步法生产的研究奠定了理论基础.
国内的环境微生物基因组研究虽然还处于发展阶段, 但是已经在国际上占有一席之地, 许多研究成果都发表在Nature, PNAS, Genome Research等国际一流杂志上, 取得了国际学术界的好评. 随着新一代测序技术的发展, 国内的菌种资源优势将会进一步呈现, 同时国内多家测序中心也相继启动了元基因组测序计划. 这些新的发展将使我国的环境和工业微生物基因组领域的研究成果出现井喷式增长.
中广泛存在. 目前利用微生物对石油污染区域进行环境治理的方法已经被广泛的采用. 16C以下的烷烃降解机制研究已经比较明确, 而16C 以上的烷烃降解机制少有报道. 长链烷烃比短链烷烃更难降解, 研究长链烷烃的降解机制有着重要的现实意义.
NG80-2是一株在我国大港油田分离得到的、当时世界上唯一已知的耐高温(温度范围45~73℃, 最适温度为65℃) 并能降解重质烷烃(碳链范围15~36C)的嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrifi-cans ). NG80-2可以产生大量的乳化剂, 对原油产生很好的乳化效果. 南开大学泰达生物技术学院王磊教授课题组在完成其全基因组测序工作的基础上, 对其进行了深入分析, 首次发现了微生物的长链烷烃降解途径, 研究成果于2007年3月发表于PNAS [14].
NG80-2全基因组包括一个3,550,319 bp的染色体和一个57,693 bp的大质粒; 预测基因3,499个, 11个核糖体操纵子和87个tRNA 基因, 占全基因组长度的86％; 基因注释显示, 2,479个基因具有已知功能, 757个基因的产物同已有的假设蛋白具有相似性, 263个基因的产物在蛋白数据库中找不到同源物, 其中有68个可能的转座子基因.
在烷烃降解机制方面, 通过生物信息学手段预测了NG80-2基因组中所有可能参与烷烃降解的基因. 之后采用荧光定量PCR 和蛋白质二维电泳、质谱分析等转录组学及蛋白组学的方法对这些基因进行了进一步的筛选, 最终鉴定了长链烷烃的降解途径, 该途径包括长链烷烃羟化酶(单加氧酶) 、醇脱氢酶、醛脱氢酶和脂酰基CoA 连接酶及β-氧化途径的多酶体系. 以长链烷烃羟化酶基因为例, 通过荧光定量PCR 实验发现, 在以原油作为唯一碳源的条件下, 质粒上的一个可能的长链烷烃羟化酶基因的表达提高了120倍. 进一步的功能验证实验鉴定其为长链烷烃羟化酶基因, 命名为ladA . 通过二维电泳和质谱等蛋白组学分析手段, 证实了ladA 基因可被原油诱导表达并分泌到膜外. 通过比较分析NG80-2分别以蔗糖和16烷为唯一碳源进行培养的二维电泳图谱, 作者构建了NG80-2降解烷烃的代谢途径. LadA作为耐热酶相比于常温酶在生物技术应用领域具有很多的优势, 另外LadA 作用过程中不需要其他辅酶, 且可溶性好、易于表达, 因此在石油环境污染治理等领域具有
2.1 长链烷烃降解细菌NG80-2的基因组学和蛋白组学研究
土壤芽孢杆菌属(Geobacillus ) 对环境有很强的适应性, 广泛存在于各种陆地和海洋环境. 它不仅存在于地热区域, 而且存在于温带和永久寒冷的区域. 由于能够产生各种热稳定的酶类, Geobacillus 已经引起了工业界的广泛兴趣.
烷烃作为原油的主要成分, 在石油污染的环境
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很高的应用价值.
在对NG80-2的代谢机制及对油藏环境的适应性分析方面. 通过代谢途径的分析发现, NG80-2拥有全套的合成嘌呤和嘧啶的基因、合成脂肪酸的基因以及合成20种氨基酸的基因; 除不能合成生物素以外, 可合成其他的维生素和辅酶, 其可能通过一个可能的生物素转运蛋白来获得生物素; NG80-2不具备Entner-Doudoroff 途径的需要的酶类, 可利用多种的碳水化合物, 例如甘油、纤维素、海藻糖及淀粉等; 进一步分析还发现NG80-2具有一整套可降解植物半纤维素木聚糖的基因并通过实验得到了证实; 转运蛋白的分析发现, NG80-2具有大量的转运蛋白, 可用来进行有效的营养吸收和去毒性反应, 以很好地适应油藏环境.
在地下油藏中, 微生物只能从采油时注入的水中获得氧气, 因此需要一个灵活的呼吸系统来很快适应多变的氧浓度, 研究发现NG80-2为兼性厌氧菌, 既可进行有氧呼吸, 也可通过硝酸盐还原进行厌氧呼吸. 其中有氧呼吸系统包括5个末端氧化酶, 厌氧呼吸系统可以将硝酸盐还原为氮气, 并且具有两套膜硝酸盐还原酶编码基因簇.
在耐热方面, 嗜温细菌受到热刺激时通常会产生热激蛋白, 以对损坏的蛋白进行移除和重新折叠. NG80-2拥有大量编码分子伴侣和热激蛋白的基因, 其中包括dnaK 操纵子、GroEL -GroES 基因、HSP33家族分子伴侣、IbpA 家族小热激蛋白、ATP 依赖的热激反应蛋白酶(HalVU, Clp, Lon)等. Makarova等 人[15]提到58个COG 家族经常在古细菌和嗜热细菌中检测到, NG80-2具有其中的3个COG 家族蛋白. 聚胺类物质经常在超级嗜热菌中发现, NG80-2同另外一株已测Geobacillus 菌株G. kaustophilus HTA426一样拥有精胺合成酶基因和聚胺转运蛋白复合物基因. 此外, NG80-2同G. kaustophilus HTA426一样, 相比于喜温芽孢杆菌具有不对称氨基酸替代, 这些可能与其嗜热性相关.
NG80-2基因组中存在着降解木聚糖和寡肽的基因, 表明NG80-2在获得降解长链烷烃的能力之前可能是一种土壤菌, 其在污染了石油的土壤中通过获得pLW1071质粒(含有ladA 基因) 从而获得了降解烷烃的能力.
2.2 腾冲嗜热厌氧菌的基因组学研究
腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcon-gensis ) 是我国科学家于1998年在云南省腾冲地区温泉内发现的杆状、革兰氏阴性厌氧真细菌. 腾冲嗜热厌氧菌生长的温度范围为50~80℃, 最适生长温度为75℃; pH值范围为5.5~9.0, 最适pH 为7~7.5. 根据16S rDNA序列的同源性比较分析发现, 腾冲嗜热厌氧菌(T. tengcongensis) 属于嗜热厌氧菌属(Thermoan- aerobacter ). 腾冲嗜热厌氧菌虽然归属于嗜热厌氧菌属, 但它有许多重要的生物学特性与同属其他细菌不同. 例如它呈革兰氏阴性、不能形成芽孢、缺乏动力以及缺乏某些代谢途径(如不能形成乳酸, 不能利用木聚糖等). 为了揭示极端嗜热菌的生命现象本质, 从分子水平上阐明嗜热菌的生命活动机制和嗜热菌在生物进化上的地位, 寻找可供开发的耐热酶基因, 中国科学院遗传与发育生物学研究所杨焕明院士课题组[16]对腾冲嗜热厌氧菌MB4T 基因组进行了破译和分析.
通过腾冲嗜热厌氧菌基因组测序发现, 该菌的全基因组大小为2,689,445 bp, 包含2,588个编码序列(CDS), 其中1,764个CDS(68.2%) 与已知蛋白质的序列同源, 其余824个CDS(31.8%) 的功能未知. 腾冲嗜热厌氧菌基因组的一个显著特征是, 在当时全基因组已经测序的所有原核生物中, 腾冲嗜热厌氧菌的基因在染色体上的分布具最大的方向性偏好, 其86.7%的基因位于先导链上. 通过全部编码蛋白的相似性比较发现, 腾冲嗜热厌氧菌与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans) 最为相似.
通过实验对腾冲嗜热厌氧菌的一些基本代谢途径进行的分析显示, 腾冲嗜热厌氧菌利用糖作为主要的碳源和能量来源; 通过厌氧性呼吸——硫呼吸途径获得能量, 但其只能利用硫代硫酸盐和单质硫作为电子受体而不能利用硫酸盐作为电子受体, 这一特点不同于绝大多数硫呼吸原核生物. 对这些途径的生物信息学分析结果与实验结果相吻合. 腾冲嗜热厌氧菌基因组含有全套糖酵解和戊糖磷酸途径所需的酶蛋白基因. 腾冲嗜热厌氧菌基因组缺乏与硫酸盐转运相关的基因, 也不具备还原硫酸盐所必需的几个主要基因. 在含硫化合物还原过程中, 硫代硫
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酸盐通常先被还原成亚硫酸盐并进一步被还原成硫化物, 硫代硫酸还原酶和亚硫酸还原酶分别是这两个反应中的关键酶, 但在腾冲嗜热厌氧菌基因组中未见编码这两种酶的基因. 相反, 发现一种硫氰酸酶相关的硫转移酶, 硫氰酸酶在氰离子的参与下, 以硫代硫酸盐作为电子受体.
从基因组分析的结果看, 腾冲嗜热厌氧菌几乎具备所有与鞭毛形成相关的基因及与化学趋化信号传导有关的基因. 但令人不解的是, 腾冲嗜热厌氧菌在实验室培养条件下不能形成鞭毛, 相应地也就不具备动力性. 作者推测, 这些“沉默的”与鞭毛运动相关的基因也许在某些特定的环境条件下会被激活, 或者不久前它们还正常表达而产生鞭毛.
腾冲嗜热厌氧菌虽为革兰氏阴性菌, 但缺乏一些革兰氏阴性菌普遍具有的基因, 相反, 它具有一些革兰氏阳性菌特征性的基因. 首先, 芽孢形成通常是革兰氏阳性杆菌的重要特征, 腾冲嗜热厌氧菌虽然在人工培养时未见芽孢, 但其基因组中却有23个与芽孢形成有关的基因; 其次, 革兰氏阴性菌具备革兰氏阳性菌不可能有的脂多糖(LPS), 腾冲嗜热厌氧菌虽然有几个与LPS 合成有关的基因, 但缺乏几个合成LPS 的关键基因; 第三, 在腾冲嗜热厌氧菌的基因组中没有找到与合成类脂Ａ有关的4个基因中的任一基因, 而这4个基因在绝大多数革兰氏阴性原核生物的基因组中都存在; 第四, 腾冲嗜热厌氧菌基因组中也没有革兰氏阴性原核生物特有的编码孔蛋白的基因.
对当时已测序的12株嗜热菌的全基因组的分析发现, 嗜热菌最适生长温度与tRNA 和rRNA 基因的G+C含量密切相关. 嗜热菌能在极端环境中生存, 有独特的种系发育特征, 表明它是通过原核生物中通过长期进化而来的一个分支. 该研究结果发表于2002年的Genome Research 上[16].
循环的环境是非常酸性的. 研究人员从新西兰地狱门的地热区域中分离得到一株嗜酸的甲烷氧化细菌V4, 这株细菌的最适生长温度在pH 2.0~2.5之间. 与已知的甲烷氧化细菌不同, 它并不属于变形菌门, 而属于疣微菌门(Verrucomicrobia ). 与之相似的细菌也在意大利和俄罗斯的地热系统中被独立地分离得到. 疣微菌是一类广泛分布但是却被很少研究的细菌世系. 虽然不依赖培养的检测方法发现这个门的细菌在环境中广泛分布, 在包括土壤、海水、温泉和人类胃肠道中都有发现, 但是其中只有很少的一部分在培养中被分离得到.
南开大学泰达生物技术学院王磊教授课题组、新西兰GNS 极端微生物研究组和夏威夷大学Alam 教授课题组合作破译得到了V4菌的全基因组序列. V4基因组是疣微菌门第一个被破译的基因组. V4菌株最初被定名为Methylokorus infernorum(后来改为Methylacidiphilum infernorum), 是一株自养细菌. M. infernorum 的基因组大小约2.3 Mbp, 只编码简单的信号传导途径, 调控少数基因的表达, 使整个基因组的运作呈流水线式.
甲烷氧化细菌利用甲烷单加氧酶来将甲烷转化为甲醇, 甲醇随后可以氧化为甲醛、甲酸和CO 2. 研究者在M. infernorum基因组中发现了编码甲烷单加氧酶的基因, 这些基因与在变形菌门中甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶有同源性. 对M. infernorum的3个pmoA 基因(编码颗粒状甲烷单加氧酶) 的遗传学分析将它们归入一个与变形菌门中同源基因不同的进化分支中. 这显示疣微菌门和变形菌门的甲烷氧化菌的分离时间很古老, 甲烷氧化能力并不是由近期的基因横向转移获得的. 这一发现显示细菌中的甲烷氧化菌比原先估计具有更加广泛的遗传背景.
M. infernorum的核心代谢系统被几乎完整的重构, 并且发现与其他甲烷利用细菌相比, 该菌的自养核心代谢途径有密切相互作用, 那些原先已知的甲醇和甲醛氧化途径也都不完整或者不存在, 这显示M. infernorum使用了全新的甲烷氧化途径. M. infer-norum 基因组并没有编码微管蛋白(在Prostheco- bacter 属中发现) 或者其他真核特征的蛋白.
核糖体蛋白和RNA 聚合酶亚基的遗传分析明确地将Planctomycetes , Verrucomicrobia 和Chlamydiae 3
2.3 极端嗜酸甲烷氧化细菌的基因组研究
需氧甲烷氧化细菌(Methylacidiphilum infer-norum ) 可以利用那些从来源地的土壤和基质中释放出来的甲烷. 这些细菌作为一个生物滤膜可减少甲烷向大气的排放, 因此它们为人类与全球温室效应的斗争提供了一种有效策略. 原先已知的甲烷氧化细菌都无法在pH 5以下生长, 然而一些有活跃甲烷
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个门归入一个单独的进化分支, 称为PVC 超门, 然而这3个门中基因组的基因组成情况却有巨大的差异. 比较基因组学分析显示M. infernorum世系的进化涉及与大量细菌的广泛横向基因转移. M. infer-norum 基因组显示出包括蛋白质整体等电点升高等对极端酸性环境的适应性.
M. infernorum的测序揭开了疣微菌门这一广泛分布且多样的细菌门的面纱. 对其分析发现了全新的甲烷利用途径, 并且证明了在极端酸性环境中甲烷氧化细菌的多样性, 为人类研究和控制地球温室效应的产生提供了新的理论基础.
该研究成果分别在2007年和2008年发表于Nature 和Biology Direct [18,19].
力, 减小其选择压力.
WP3菌株拥有55个可能的c 型细胞色素基因, 根据序列相似性, 这些基因可分为17个组. WP3可以利用各种电子受体, 如硝酸盐、延胡索酸、三甲胺氮氧化物(TMAO)、二甲基亚砜 (DMSO)和不溶金属物等. 大量的c 型细胞色素基因存在有利于WP3适应高压的深海环境.
相比于MR-1菌株, WP3具有多种分解代谢途径, 可以利用淀粉、蔗糖、戊糖、果糖、甘露糖、核糖、胺糖、半乳糖、多聚糖(黏多糖等) 等, 这些途径为WP3适应深海营养贫瘠环境提供了保障.
在低温和高压环境中, 微生物的细胞膜流动性会发生很大的变化. WP3基因组有一个可以合成二十碳五烯酸EPA 的基因簇, 二十碳五烯酸EPA 在细胞膜中的含量随着温度的降低而增多, 可以帮助WP3适应低温环境.
WP3拥有7个假尿苷合成基因, 9个假尿苷酸合成基因和3个RNA 修饰基因. 通常情况下, 细菌拥有1~4个这样的基因拷贝, 这是第一次发现如此多假尿苷合成基因存在于单一细菌基因组中. 希瓦氏菌株PV-4, MR-4, MR-7, CN-32, SB2B等基因组中也有类似的情况存在. 大量结构RNA 修饰基因的存在可能是希瓦氏种属适应各种环境的重要机制.
此外研究还发现WP3拥有两套鞭毛系统, 两套鞭毛系统在低温和高压下受到不同的调节, 其中侧部鞭毛是其在低温环境下移动和生存所必需的.
对耐冷耐压希瓦氏菌株WP3基因组的研究, 加深了人们对于希瓦氏种属环境适应性的认识, 同时促进了人们对微生物耐冷耐压机制的认识.
2.4 耐压耐冷菌Shewanella piezolerans WP3基因
组学研究
希瓦氏属(Shewanella ) 在各种环境中广泛存在. Shewanella piezotolerans WP3 是一株耐压耐冷铁还原细菌, 分离自深海沉积物中. 为了研究WP3对高压低温环境的适应性机制, 国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室和华大基因研究中心合作, 对Shewanella piezotolerans WP3的全基因组序列进行了分析, 相关文章发表于PLos One
[17]
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WP3基因组全长5,396,476bp, 预测基因4,944个, WP3基因组是已测希瓦氏菌株基因组中最大的. 其中3326个蛋白具有已知功能, 877个蛋白为保守的假设蛋白, 741个蛋白为假设蛋白. WP3基因组同S. loihica PV-4的基因组序列相似度最高, S. loihica PV-4为一株分离于深海热泉的耐冷菌, WP3 和PV-4基因组的大部分区域基因排列一样, 整个基因组比对成X 模式, 表明在复制起点和终点附近存在大量的基因重排事件.
同其他已测希瓦氏菌株基因组序列进行比较发现, WP3基因组之所以很大程度上与其存在大量的基因复制有关. 研究者对希瓦氏MR-1菌株和WP3菌株的旁系同源蛋白家族进行了分析, 发现在每一个旁系同源蛋白家族中, WP3菌株比MR-1菌株包含更多的家族基因. 在WP3中, 这些扩展的蛋白家族主要分布在转运、分泌、能量代谢和转录调节方面. 大量的复制基因的存在可以增强WP3应对环境变化的能
2.5 斯氏假单胞菌A1501的基因组学研究
固氮作用在细菌和古细菌中广泛存在, 但是一直都没有在假单胞菌中发现. 斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是我国科学家于1980年从水稻根际土壤分离到的一株具有良好固氮能力的联合固氮菌. 20多年来, 科学家们对该菌的生理生化以及遗传特性进行了深入的研究. 中国农科院林敏教授课题组对斯氏假单胞菌A1501的全基因组分析发现这个基因组由一个4.56 Mbp的环状染色体组成[20]. 比较基因组学显示出4,146个蛋白质编码基因, 其中
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1,977个在其他5株假单胞菌的全基因组序列中有同源基因. 这个基因组包括了涉及广泛的碳源利用基因、氮固定基因、芳香烃降解基因以及其他许多可能使它在根定植中有利的基因.
通过对基因组的分析, 发现了与固氮作用相关的基因蔟, 在A1501的基因组中有多个固氮相关基因, 这些基因以基因簇的形式存在于染色体上, 总长度约50 kb, 基因的平均GC 含量为66.8%. 在A1501株的基因组上鉴定了4个反硝化相关的基因簇: nar , nir , nor 和nos , 共40个基因, 基因的转录产物与其他种群中物质运输、基因调控以及还原酶类蛋白高度同源, 显示这个功能是由后遗传转移得到. 在nif 岛中发现了新的氮固定必须基因.
从基因组学水平对斯氏假单胞菌A1501进行研究, 可以在一个新的层次全面认识该菌的各种代谢网络及固氮机制, 从系统学的角度出发, 深入探讨固氮系统的调节机制, 氮循环(包括氨基酸循环、固氮以及反硝化) 的整体调节以及寻找碳代谢及氮代谢之间的新的偶联作用及其分子机理, 在已有的开发基础上进一步开发高效的固氮耐盐工程菌株; 克隆新的重要功能基因并申请专利, 探索固氮菌与植物之间的相互作用机制, 最终能够开发一套高产、低耗、耐盐的微生物-植物相互作用的耕作体系.
该研究成果于2008年发表于PNAS [20].
结果进行分析, 共鉴定出5360个可读框(ORF), 先导链编码2630个, 滞后链编码2730个. 其中3818个为功能已知的基因, 1445个为功能未知, 但与数据库里的蛋白序列具有显著同源性或部分同源的ORF, 87个与任何公布的序列都没有同源性. 目前关于Q1蜡状芽孢杆菌中功能基因的研究正在进行之中.
维生素C 又称抗坏血酸, 是人体必需的一种维生素, 在医药和食品工业中均有重要用途. 20世纪80年代我国科学家发明了维生素C 生产的“二步发酵法”. 此工艺采用生物过程代替了化学过程, 具有成本低、无污染等优势. 但这一生产工艺包括两步3种菌, 存在操作繁琐、易于污染等缺点, 仍然不尽理想. 因此有必要以现代基因操作技术改造现有生产菌株, 将两步发酵法改为一步发酵法. 病毒基因工程国家重点实验室与华北制药集团联合, 选择二步发酵法中的第二步产酸菌酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp) WB0104进行功能基因组的研究工作. 基因组学分析显示酮古龙酸菌基因组是一长度为2,765,030 bp的环形染色体和两个环状质粒(大小分别为267,968 bp和242,707 bp), 染色体的G+C含量平均为61.69%, 包含2,727个ORF. 在所有编码序列中, 72.4%有明确的生物学功能, 17.7%功能不明. 课题组通过基因组生物信息学分析、基因芯片、蛋白纯化、基因表达和蛋白质谱分析等技术手段发现了一系列与古龙酸代谢密切相关的关键基因, 包括山梨糖脱氢酶基因家族, 辅酶PQQ 的合成基因簇, 多亚基的山梨醇脱氢酶等. 对这些基因及基因簇都进行了大肠杆菌重组表达, 并进行了体外活性实验, 同时结合液相、质谱等手段对这些关键酶的底物特异性、酶学特性等进行了研究, 为进一步对产酸菌进行遗传改造, 进行一步发酵工程菌的构建及发酵工艺的改进奠定了基础.
2.6 其他环境与工业微生物的基因组学研究
Q1蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 是大庆石油管理局通过大量的室内筛选、评价和矿场实验得到的工业菌株. 该菌株可降解C20~C40的重质碳链, 降黏率可达70%以上, 其适应温度为28~99℃, 适用于我国绝大多数地质和地层条件, 具有良好的应用价值. 同时该菌株还具有降低界面张力的能力, 进入现场实验后也取得了较好的降粘增油效果. 选用此菌株进行基因组学的研究并在此基础之上进行功能基因的研究和基因工程菌株的改造, 不仅可以应用于大庆的地质条件, 还可以应用于全国不同的油田, 并且具有广阔的国际应用前景和深远的科研意义. 中国病毒基因工程国家重点实验室金奇教授课题组已完成了Q1蜡状芽孢杆菌全基因组的破译. 基因组全长5,214,195 bp, 编码区占85%, 平均每个编码序列长830 bp. 对注释
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3 小结
在过去几年中, 我国的环境微生物基因组学领域呈现出了快速发展的趋势, 已经初步建立了具有世界水平的先进研究平台, 凝聚了一批该领域在国际上享有一定知名度的队伍和人才, 具有了较好的工作基础.
目前, 国内多家研究单位相继拥有了新一代的测序平台, 结合已经拥有的优秀的科研团队, 与生物
中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第10期
信息学分析和蛋白质组学研究能力的同步提高, 必将使我国今后几年在环境微生物的基因组学研究领域取得一批具有重要影响力的原创性成果. 十一五期间, 我国启动了国家高技术研究发展计划(863计划) “资源
环境技术领域”的重点项目, 国家重点基础研究发展计划(973计划) 、国家自然科学基金等也在环境微生物学领域有一定的资助. 可以预见, 今后几年我国将在环境微生物基因组学研究领域实现重大突破.
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