培养基的配制原则：1. 培养基是供微生物生长繁殖和代谢的营养基质。
2. 含有生物必须的C 源、N 源、能源、无机盐、生长因子、水分。
3. 适宜的PH ，一定的缓冲能力，一定的还原电位和渗透压。
4、液体培养基中加0.5—1%的琼脂，半固体：1—2%的琼脂。
培养基配制应注意什么？
1、 配固体培养基不断搅拌防止琼脂糊底、溢出
2、 称药品的牛角匙不要混用，称完药品及时盖盖
3、 调PH 时要小心避免多次回调，调PH 要在加琼脂之前
4、 分装要注意不能使培养基粘在管上以免污染过的棉塞再引起试剂污染
5、 配好要检查是否灭菌成功
各种灭菌法的原理和使用范围？
1、 高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽很高的压力和温度，使菌体的酶蛋白质凝固变性从而灭菌。
培养基、玻璃器皿、水、缓冲液、金属用具、实验服及传染性标本等
2、 干热灭菌法：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到目的。玻璃器皿
3、 过滤除菌：通过机械作用滤去液体或气体中的细菌、真菌孢子。酶液、抗生素等不耐热
溶液的灭菌。
高压蒸汽灭菌法操作步骤：
1、 加水 2、装料 3、加盖 4、排气 5、升压 6、保压 7、降压 8、无菌检查
使用高压灭菌锅时应注意什么？
1、 使用前切勿忘记加水并且水量不可过少，以防止灭菌锅烧干引起炸裂，在灭菌过程中操
作者切勿擅自离开，随时注视压力的变化。
2、 必须待锅里冷空气排尽后才能关上排气阀，灭菌完毕后等到压力降到0后才能打开排气
阀，开盖取物。否则由于锅内压力骤然下降培养基由于容器的内外压力不均衡而喷出试管，使棉塞受污染甚至烫伤操作者。
3、 灭菌物品不宜摆放的太挤。
分离、纯化的原理：
概念：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。
方法：单细胞挑去法、平板划线法、稀释倒平板法
原理：含有各种微生物的土壤悬液进行稀释后涂布接种到各种选择培养基平板上，在不同条件下培养，从而使各类微生物在各自的培养基上形成单菌落。
造成土壤中实际存在的微生物数量可能估计过低的原因？
1、 土壤悬液中有的菌成群聚集在一起或附在土壤粒上未被分散
2、 稀释液可能杀死某些微生物
3、 有的孢子在这种条件下不能萌发，因而不能形成肉眼可见的菌落
4、 有的细胞在操作过程中被吸附在管壁上
5、 培养基和培养条件有较高的选择性，以至相当一部分微生物不能正常发育形成菌落 油镜的使用原理：油镜的放大倍数可达到100X ，但其焦距和直径很小，需要很大的光照强度，当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃的折（n=1.52）射率不同，透过载玻片的光线有一部分因折射不能进入镜头降低了视野的照明度。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，从而提高视野的照明度和分辨率。
油镜观察步骤
1提起油镜约2cm 将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴一滴香柏油。
2从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压挤装片，以免压碎装片，损坏镜头。
3将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升，当视野中有物象出现时，在用调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物象，必须在从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至看清为止。仔细观察并绘图。
4再次观察。提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜，高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。
镜检完毕后的工作
1移开物镜镜头
2取出装片
3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯
4擦净显微镜，将各部位还原。
使用油镜应特别注意哪些问题？
1、 使用油镜必须按照先用低倍镜和高倍镜观察，然后再用油镜观察的顺序进行
2、 下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜头的错误操作，
以免压碎玻片而损坏镜头
3、 使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防止溶解固定透镜的树脂。
4、 注意保持显微镜的清洁，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或
用普通布，纸等，以免损坏镜头
影响显微镜分辨率的因素有哪些？
数值孔径（镜口角，介质折射率），入射光波长
细菌形态观察应注意
1擦镜头时，只能用擦镜纸
2不能再油镜下直接取下和替换装片
3无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多
4活体装片光线调暗，染色装片光线调亮
单染色法原理
细菌在中性，弱酸，碱性溶液中带负电荷，碱性染料在电离后染色离子在正电荷，因此使细菌着色
涂片在染色前为什么要固定？固定时应注意什么问题?
目的：使细胞质凝固从而使细胞形态固定并使细菌粘附在玻片上
注意：温度不宜过高，防止细胞死亡变形
制备染片时应该注意哪些事项？制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
要将涂片置于水平位置，染液要全部覆盖于涂菌处
未干燥的涂片上有水，用油镜观察时，改变了其折射率，从而不能达到所要观察的效果 制备细菌染色标本时应注意哪些环节？
（1）载玻片要清洁无脂，否则菌液涂不开
（2）涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄
（3）热固定时温度不宜过高
（4）冲洗时不可将水流直接对准菌固定处
为什么必须用培养24小时的菌体进行革兰氏染色？
避免菌种老龄化而体内核酸减少，使阳性被染成阴性，干扰观察结果
革兰氏染色注意事项：1、涂片均匀不可过厚2、染色过程中不可使染液干涸3、脱色时间应
控制严格30S —1MIN 4、水洗不可直接冲洗涂面5、选菌种年龄很重要，太老会使阳变阴