离心分离技术
离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。
一、离心机的种类与用途
离心机按用途有分析用、制备用及分析-制备之分；按结构特点则有管式、吊蓝式、转鼓式和碟式等多种；按转速可分为常速（低速）、高速和超速三种。
1．常速离心机
常速离心机又称为低速离心机。其最大转速在8000 rpm以内，相对离心力（RCF ）在104g 以下，主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，和粗结晶等较大颗粒。常速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样，可根据需要选择使用。
2．高速离心机
高速离心机的转速为1x104~2.5x104 rpm，相对离心力达
1x104~1x105g，主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机装设了冷冻装置，称高速冷冻离心机。
3．超速离心机
超速离心机的转速达 2.5x104~8x104 rpm ，最大相对离心力达5x105g 甚至更高一些。超速离心机的精密度相当高。为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽；为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。此外还有一系列安全保护系统、制动系统及各种指示仪表等。
分析用超速离心机用于样品纯度检测时，是在一定的转速下离心一段时间以后，用光学仪器测出各种颗粒在离心管中的分布情况，通过紫外吸收率或折光率等判断其纯度。若只有一个吸收峰或只显示一个折光率改变，表明样品中只含一种组分，样品纯度很高。若有杂质存在，则显示含有两种或多种组分的图谱。
分析用超速离心机可用于测定物质的沉降系数。沉降系数是指在单位离心力的作用下粒子的沉降速度。以Svedberg 表示，简称S, 单位秒， 1S=1x10-13s。
S可通过超速离心，根据转速、离心时间和粒子移动的距离，按下列公式求出：
式中ω：角速度；t2-t1：离心时间（s ）；X2,X1：分别为t2和t1时，运动粒子到离心机转轴中心的距离（cm ）。
沉降系数与相对分子质量有一定的对应关系。
二、离心分离方法的选择
离心分离的方法可分为三类：
1．差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能获得较纯的分离产物。
差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差。
2．密度梯度离心
密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的组分得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活，常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度5%~60%，密度1.02~1.30 g/cm3。
密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清晰的不连续区带。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。 在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可减少区带扩宽。
3．等密度离心
将CsCl2、CsSO4等介质溶液与样品溶液混合，然后在选定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场中沉降形成密度梯度，样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形成区带。前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。
应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度和离心机转速及离心时间。此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性，故最好使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干燥。
三、离心条件的确定
离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间。此外还要注意离心介质溶液的pH 值和温度等条件。
1．离心力
物质颗粒在离心场中所受到的离心力（Fc ）的大小，决定于颗粒的质量(m)和离心加速度(ac): Fc=m ac
离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径：ac =ω2r 式中ω：转子的角速度（rad/s）；r ：旋转半径，即颗粒到旋转轴中心的距离(cm)。
若转速以惯用的每分钟转数（r/min）来表示，则：
式中n: 转子每分钟转数（r/min）
在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示，如4000 rpm ；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如65000g 。
相对离心力是指颗粒所受的离心力与地心引力（重力）之比。即 RCF=Fc/Fg=1.12×10-5*n2*r×g
式中RCF ：相对离心力（g ）；n ：转子每分钟转数（rpm ）； r：旋转半径(cm)；g ：重力加速度，980.6 cm/s2
由此可见，离心力的大小与转速的平方及与旋转半径成正比。在转速一定的条件下，颗粒离轴心越远，其所受的离心力越大。在离心过程中，随着颗粒在离心管中移动，其所受的离心力也随着变化。在实际工作中，离心力的数据是指其平均值。即是指在离心溶液中点出颗粒所受的离心力。
2．离心时间
离心时间的概念，依据离心方法的不同而有所差异。对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。对等密度梯度离心而言，离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间；而密度梯度离心的时间则是指形成界限分明的区带的时间。
密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过实验来确定。差速离心所需的沉降时间可通过计算求得。
颗粒的沉降时间是指颗粒从离心样品液面完全沉降到离心管底所需的时间，又称澄清时间。沉降时间决定于颗粒沉降速度和沉降距离。 对于已知沉降系数的颗粒，其沉降时间可由下列公式计算：
式中 t：沉降时间（s ）；S ：颗粒的沉降系数（1x10-13S ）；ω：转子角速度（rad/s）；r1,r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm ）。
上式中括号部分对特定转子而言唯一常数，称转子效率因子或K 值。即
转子的效率因子K 与转子的半径和转速有关。对于具有某一沉降系数S 的颗粒而言，K 值越小，其沉降时间越短，转子的使用效率就越高。 对于不知其沉降系数的球形颗粒，可按下是估算其沉降时间：
式中T ：沉降时间（s ）；μ：介质溶液的黏度（g/（cm.s ））；ρ，ρ0：分别为颗粒和介质溶液密度（g/cm3）；d ：颗粒平均直径（cm ）；r1,r2：分别为旋转轴中心到离心管底和液面的距离（cm ）。
3．温度和pH 值
为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的Ph 值等离心条件。离心温度一般控制在4℃左右，对于某些热稳定性较好的酶等，离心也可在室温下进行。但在超速或高速离心时，转子高速旋转会发热从而引起温度升高。故必须采用冷冻系统，使温度保持在一定范围内。离心介质溶液的pH 值应该是处于酶稳定性的pH 范围内，必要时可采用缓冲液。另外，过酸或过碱还可能引起转子和离心机的其他部件的腐蚀，应尽量避免.