谷氨酸摇瓶发酵
生物工程xxx xxx xxxxxxxxx
摘要 根据谷氨酸的发酵机理，本实验通过摇瓶补料发酵生产谷氨酸，并对发酵过程中产谷氨酸量、发酵液OD 值、残糖量进行连续的测定。试验结果表明：四瓶发酵培养基中，只有添加有玉米浆的发酵培养基产谷氨酸，另外3瓶以酵母膏代替玉米浆成分的发酵液都不产谷氨酸。 关键词：谷氨酸 发酵 摇瓶培养
前言
1.1 谷氨酸发酵机制
在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有三种：（1）谷氨酸脱氢酶（GHD ）所催化的还原氨基化反应；（2）转氨酶（AT ）催化的转氨反应；（3）谷氨酸合成酶（GS ）催化的反应。
谷氨酸的合成主要途径是α—酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。α—酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径如下图1所示，至少有16步酶促反应。
图1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制
在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。 1.2 谷氨酸生产菌种的选择
目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌、天津短杆菌等。为革兰氏阳性菌，菌体为球形、短杆状和棒状，不同形状芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能生产谷氨酸。本实验选择天津短杆菌来摇瓶发酵生产谷氨酸。 1.3 谷氨酸发酵过程控制
谷氨酸发酵过程中，产生菌种的特性、生物素、发酵温度、pH 值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中只有针对存在的问题，严格控制工艺条件，才能达到稳产、高产的目的。
发酵初期，菌体生长迟滞，约2～4h 后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH 值至7.5～8.0，同时保持温度为30～32℃。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12h 。
随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α-
酮戊二酸和氨主要用来合
成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.2～7.4，需大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成最适温度34～37℃。
发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，这时应减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐，发酵周期约为30 h。
材料和方法
2.1 菌种选择：天津短杆菌。 2.2 实验器皿的准备：
带10ml 刻度的比色管24支，离心管12个，枪头灭菌并烘干（80℃烘4小时）约200支，灭菌移液管1ml5支。
2.3 配置培养基及相关试剂： 2.3.1活化斜面培养基（g/L）（5支，10ml/支）
葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl12.5，琼脂15～20，Ph7.0～7.2，分装大试管约10ml/支，灭菌：115℃，25min ，斜面高度占试管高度的2/3。
2.3.2种子培养基（g/L）（2瓶，30ml/瓶）
葡萄糖26，玉米浆40，K 2HPO 41.4，MgSO 40.8，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装30ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min 。在无菌室加入尿素后调节pH7.0～7.2。
2.3.3摇瓶发酵培养基（g/L）（6瓶，30ml/瓶）
葡萄糖70/80/90，玉米浆（或酵母膏）3，MgSO 40.8，K 2HPO 43.5，K , H 2PO 41，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装26ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min 。在无菌室加入尿素后调节pH7.2～7.5。
2.3.4相关试剂的配制
1）0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl 溶于蒸馏水并定溶至100ml 。
2)50%葡萄糖配法：称取50g 葡萄糖溶于蒸馏水并定溶至100ml ，用于补料。 3）20%尿素：称取22g 尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml ，过滤除菌。
4）3mol/LHCl：取12mol/L浓HCl ，令HCl:H2O 为1:3（体积比）配制100ml 。 5）2mol/LNaOH：称取8gNaOH 固体溶于蒸馏水并定溶至100ml 。
2.4 实验步骤
2.4.1转接活化斜面：
将菌种TG866转接划满活化斜面，32℃培养20h 。
2.4.2种子培养：
向已灭菌的种子培养基加入尿素（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.0～7.2。按1ml 生理盐水/1支大试管斜面的用量，将活化斜面上菌种洗下，混匀。按3%的接种量（1ml ）接入种子培养基，9层纱布封口，240rpm ，32℃摇瓶培养7～8h 使菌体长至对数生长中后期。 2.4.3测定OD 620值：
0h 测一次，7h 测一次，若OD 值净增0.5以上（一般达到0.7以上比较好）则放入冰箱保存待用。接入发酵培养基时从两瓶中选用一瓶。 2.4.4摇瓶补料发酵：
向已灭菌的发酵培养基加入尿素，（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.2～7.5，将种子培养基按10%的接种量（3ml ）将种子液接入发酵培养基中，9层纱布封口，240rpm ，32℃摇瓶发酵约30h 。测定0h 的OD 620值。 2.4.5
在无菌台取样0.5ml 至离心管中，残液测定pH 值，酌情加入尿素0.2～0.6ml 补料，使pH 值维持在7.2～
7.5，酌情加入50%的葡萄糖溶液补料（加入量约0.5～1.2ml ，视具体情况而定），使残液维持在20～30g/L，测定OD 620值和残糖量，每隔3h 做一次连续进行至晚上10点，酌情补料。 2.4.6
每隔3h 做一次连续进行至40h 。 2.5 测定方法
2.5.1菌种生长情况
吸取0.5ml 发酵液于1.5ml 离心管中，8000r/min离心3min ，上清液用于测量残糖量和谷氨酸产量，沉淀稀释100倍，用722光栅分光光度计在620nm 波长下测其OD 值，菌种OD 值可以反映菌体的浓度，通过菌体浓度可知菌体生长情况。 2.5.2残糖量和谷氨酸量的测定
上（1）中的上清液稀释100倍（取0.1ml 稀释至10ml ），用生物传感分析仪测定残糖量和谷氨酸量。2.5.3 pH值的测定
用pH6. 4～8.0的pH 精密试纸测定pH 值。
实验结果和分析
3.1 四个梯度的发酵液中OD 值变化
图3-1 4个梯度的发酵液中OD 值随时间变化曲线图 3.2 葡萄糖70 加酵母膏①梯度发酵液中OD 值、残糖量及谷氨酸产量变化
图3-2 葡萄糖70 加酵母膏①发酵液中OD 值、残糖量及谷氨酸产量随时间（h ）变化曲线图
3.3葡萄糖70 加玉米浆②梯度发酵液中OD 值、残糖量及谷氨酸产量变
图3-3 葡萄糖70 加玉米浆②发酵液中OD 值、残糖量及谷氨酸产量随时间（h ）变化曲线图 3.3 实验结果分析
（1）由图3-1可以看出这4个梯度的发酵液OD 值在0—24h 范围内基本上呈现上升趋势，因为菌体的OD 值可以反映菌体的浓度，因此可知在1—24h 内，这4瓶发酵液内菌体生长量都在增加。其中，葡萄糖70 加酵母膏①梯度的OD 值较其它3个梯度的高，说明其培养基营养丰富，菌体生长较旺盛。到24h 后，葡萄糖100 加酵母膏②梯度和葡萄糖70 加酵母膏①梯度的OD 值开始下降，而另外两梯度仍有上升，说明此时葡萄糖100 加酵母膏②梯度和葡萄糖70 加酵母膏①梯度发酵液菌体进入衰退期，菌体开始自溶，而另两个梯度的发酵液中菌体数量仍在增长。
（2）这4个梯度的发酵培养基中，添加酵母膏的三瓶发酵液均不产酸，另一瓶添加玉米浆的的发酵液产酸，这是因为在发酵培养基中添加了酵母膏，使得培养基中营养丰富，生物素量过多，酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸，同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸，菌体生长繁殖快，同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成，使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出，谷氨酸合成途径受阻，因而不产酸；而另一瓶添加了玉米浆的发酵培养基，因其营养成分适宜，生物素处于亚适量，菌体代谢失调，细胞膜通透性增强，细胞内的谷氨酸能及时排出，有利于谷氨酸的积累，因而产酸量较高。
（3）由图3-3可以发现，从3h 开始积累谷氨酸，在6—12h 这段时间内残糖量突然下降，而OD 值上升较快，谷氨酸含量曲线相对较平，产酸量较少，是因为产菌速度快，产酸率低；OD 值上升快，产菌量多，耗糖快 ，主要是因为培养基营养丰富，生物素过量，pH 低，流加液氨不及时。
（4）产酸量较少的原因可能是在实验过程中加糖量和加尿素量控制不够合理，从而使残糖量和pH 值产生较大的波动；另一方面也可能是接种量不够或菌种生物活性、温度、培养基营养成分等也有关系。
讨论和小结
1、 在发酵过程中，氧、温度、pH 和磷酸盐等因素都会影响到菌体的生长和产酸，因此，应对它们进行调节
和控制如下：
①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。
②温度。菌种生长的最适温度为30～32 ℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因
此，在发酵后期，可将温度提高到34～37 ℃。
③pH 。谷氨酸产生菌发酵的最适pH 在7.0～8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产
物的积累，培养液的pH 会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH 会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH 会下降。其中谷氨酸棒状杆菌在pH 呈酸性时生成乙酰谷胺酰胺。
④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。
⑤生物素。在谷氨酸发酵过程中，生物素的主要作用是作为乙酰辅酶A 的辅酶影响磷脂的合成，进
而影响谷氨酸产生菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途。因此，前期，即菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而到了产物合成期，则要限制生物素亚适量，以保证产物的正常合成。 ⑥泡沫。泡沫形成泡盖时，代谢产生的气体不能及时排出，妨碍菌体呼吸作用，影响菌体的正常代谢；
泡沫过多，发酵液会外溢，造成浪费和污染；泡沫过多，易冲上灌顶，造成染菌。因此，在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。
2、添加酵母膏的发酵培养基和添加玉米浆的发酵培养基相比，添加有玉米浆的发酵培养基有利于谷氨酸发酵产酸。
3、种子培养基要求含有丰富的氮源，足够的生物素，少量的碳源，以利菌体生长，如果糖份过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH 值降低，菌种容易衰老。而对于发酵培养基来说，则要求生物素亚适量，因为只有在生物素亚适量的环境下，谷氨酸产量才高。
4、为了防止尿素受高热分解产生氨引起培养基起始pH 值过高，以及尿素缩合形成缩尿而抑制菌体生长，
因此尿素灭菌温度不能太高，加热时间不能太长。
5、接种量过少，菌体增长缓慢，适应期长，培养时间长，影响种子活力，但种量过多，发酵周期短，不利于产酸。
6、发酵前期，菌体生长和糖消耗量均快，菌体繁殖和谷氨酸大量积累， 加入尿素的量应相对的多些， 以提供氮源和调节pH 。发酵后期，残糖很少，菌体衰老，细胞内酶活力下降，加入尿素的量应减小，对于pH 的控制，要做到前期不低，中期不降，后期不高。所以在发酵中后期，为了促进谷氨酸的生成，应尽可能保持发酵液p H7.2左右。
参考文献
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附录：发酵过程实验原始数据记录： 12月24日 周一
2）10点五分，往葡70（加酵母膏）1号补加1.5ml 葡萄糖
12月25日周二