组织和细胞中Ca2+浓度测定的研究进展 边原1 肖洪涛2 陈璐（四川省人民医院·四川省医学科学院 药剂科，四川成都 610072） 中国分类号 文献标识码 文章编号
摘要：组织和细胞内的Ca2+与信号传导以及生理病理方面应答反应具有重要的联系。因此测定组织和细胞内的Ca2+含量及动态变化具有重要的研究意义。近年来组织和细胞内Ca2+ 的测定技术和相关机理研究在国内外发展迅速，包括45Ca跨膜流动测定方法、X射线微区分析技术、离子选择微电极技术、核磁共振波谱技术、原子吸收分光光度法测定技术、荧光探针技术等，本文就相关方面介绍这些方法的特点和主要的应用情况。
关键词：组织和细胞内Ca2+；测定技术；研究应用；
Ca2+在人体体内不但具有重要的生理作用，在组织或细胞产生病理反应时其浓度还能反映机体或细胞的病变程度，同时Ca2+作为细胞内的信息传递物质,具有调节细胞功能、参与信号跨膜传递以及介导细胞对外界刺激的应答反应等重要作用[1,2]。因此，组织或细胞内Ca2+浓度测定方法的研究和改进，对临床和药学相关实验具有重要的意义。
1. 45Ca跨膜流动测定方法
同位素45Ca (T1/2=163 d, β射线能量为0.25 MeV )与生物体中的钙具有相同的生物活性, 由于45Ca发出的β射线能被探测, 因此只要测量45Ca 进入细胞内的数量变化就可快速、直观地反映出药物对Ca2+通道的阻滞特性。平滑肌细胞膜上一般存在有三种Ca2+通道① 静流钙通道②受体钙通道③电压依赖钙通道。欲真实地测量通过每一种钙通道进入细胞中45Ca的量, 必须全部除掉在细胞膜外面的45Ca。该方法采用冷EGTA络和法测量45Ca进人细胞的量。该方法既能除去细胞外的45Ca2+, 又能确保已进人细胞中的45Ca2+不重新流出细胞外。国内有研究者将此方法用于动物组织包括心肌、主动脉等进行测定，效果较好，同时为中药对钙通道的影响提供了较好的方法，具有用样少、操作简便、快速灵敏、重现性好等优点[3-5]。
2.X 射线微区分析技术
X射线微区分析技术利用电子束轰击样品，入射电子将样品内被测元素的内层电子逐出。当外层电子跃迁填充其空位时释放能量， 产生特征x射线。特征X射线是入射电子激发外层壳电子释放的，其能量和波长为每种离子所固有，通过测定这些能量和波长就有可能进行元素定性分析，进行定量分析的基础在于特征x射线的强度与样品中所含元素的浓度有关。目前X射线微区分析技术能够成功地用于测量细胞内肌浆网和内质网等细胞器所含的钙离子浓度[6]。
林支付等[7]应用定量X射线微区分析技术结合细胞化学技术, 分析测定用单纯冷冻法保存离体猫肾脏过程中肾脏细胞的胞浆、线粒体、内质网、细胞核等细胞器内的Ca2+ 浓度变化。研究发现保存过程中, Ca2+ 由内质网进入胞浆中, 线粒体在胞浆Ca2+ 浓度高时摄取Ca2+ , 而钙通道阻滞剂可抑制该过程。因此, 在肾脏移植中, 人们在肾保存液中或在术后受肾者药中添加Ca2+ 通道阻滞剂, 以增加保存后肾脏的活力, 减少移植后再灌注对肾脏的伤害。王翠1基金项目：四川省2009年第三批支撑计划项目（项目编号：2009SZ0226） 边原,(1983-),男,硕士学位,药师,研究方向:药物生物利用度、药代动力学, Tel：([1**********])，Email： 肖洪涛,(1975 - ) ,男,硕士学位,主管药师,研究方向:临床药理学、中药药理学,通讯作者, Tel: (028)87393316, 2
Email: xht927@163.com
娥等[8]通过研究抗疟药磷酸萘酚奎对大鼠肝脏细胞的损害程度，发现电子显微镜下高剂量组大鼠的肝细胞超微结构发生明显变化，同时利用X射线微区分析技术发现大鼠高剂量组肝细胞内Ca2+ 离子浓度与对照组有明显的差异，进一步研究表明了Ca2+ 浓度的持续升高可以活化细胞的毒性机制,最终导致细胞死亡。Pozzo-Miller等[9]最新研究发现细胞内内质网上的钙库具有非均匀性。研究者通过电刺激海马神经元树突发现一些内质网囊状结构的Ca2+浓度出现非常强劲的增长，与此同时其它一些囊状结构却没有应答反应。目前此研究法在形态学识别细胞器内钙离子浓度方面具有最高的分辨率。
3.离子选择微电极技术
离子选择性微电极（ISME）是一种能测定细胞等生物微环境内单一离子活度的信息传感器，其主要特点是微型化，尖径在1μm之内，能在不损伤细胞的情况下，直接插入单个细胞内，运用电位测定法测定细胞内的离子浓度。所以IMSE对研究细胞的生理功能十分重要，目前广泛应用于生物医学、临床检验和药物分析等。杨红芸等[10]利用自制钙离子选择性微电极建立血清样品中钙离子测定方法，研究结果表明 Ca2+- ISM E 可用于内源性药物钙制剂的药物代谢动力学研究。
4.核磁共振波谱技术
核磁共振(NMR)波谱技术是一种无损伤研究生物样本的重要手段,能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测。细胞内游离Ca2 + 在生物细胞生理功能中起着非常重要作用,对Ca2 +浓度的准确检测可对许多生理过程有更深入的认识,并对药物作用机制的研究有重要作用[11]。
19FNMR 是细胞内Ca2+ 测定的非光学方法，由于正常生物体内含氟成分很少，为了得到足够的响应，在检测游离Ca2+ 浓度时需要使用含氟指示剂，目前常用的指示剂为nF-BAPTA[n fluoro-1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N＇,N＇tetraacetic acid]衍生物。nF-BAPTA不能以游离酸形式直接进入细胞内部,需要经过化学修饰以乙酰氧甲酯（acetoxymethyl-ester,A M ）的形式（n F - B A P T A - A M ）进入，之后在细胞内水解，重新成为游离酸形式，与细胞内游离Ca2+结合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。这种结合具有快交换和慢交换两种性质，取决于Ca2+ 相对于nF-BAPTA的解离程度Kd。用核磁共振检测具有快交换性质的5F-BAPTA 在NMR 波谱图上得到2 个峰：结合Ca2+ 的Ca2+-5F-BAPTA 峰和未结合Ca2+ 的5F-BAPTA 峰，由两峰的峰面积比和解离常数，可计算细胞内游离Ca2+浓度；对于具有慢交换性质的4F-BAPTA 会出现单峰，利用结合与未结合Ca2+ 的4F-BAPTA化学位移计算Ca2+浓度[12]。
5.原子吸收分光光度法测定技术
原子在一般情况下处于能量最低状态（基态）。当原子吸收外界能量被激发时，其最外层电子可跃迁到较高的不同能级上（激发态）。处于激发态的电子很不稳定，一般在极短的时间便跃回基态（或较低的激发态），此时原子以电磁波的形式放出能量。原子吸收分光光度法是基于从光源辐射出具有待测元素特征波长的光通过试样原子蒸气时，被蒸气中被测元素的基态原子所吸收，然后利用光被吸收的程度来测定被测元素的含量。它具有测定灵敏度.高、检出限小、干扰少、操作简单、快速等优点。毛亚伦等[13]利用原子吸收分光光度法、荧光指示剂法以及细胞膜酶活性法研究感染严重程度与红细胞膜钙泵、细胞内外钙离子浓度关系，结果表明感染患者存在细胞外钙向细胞内流动,导致细胞功能紊乱、损害甚至死亡。
6. 荧光指示剂测定技术
荧光指示剂测定法是用具有特异性与细胞内游离钙离子结合的荧光探针或染料,以其与钙离子结合后荧光强度所发生改变通过成像、激光共聚焦显微技术等测算细胞内钙离子含量的一种方法,目前应用较为广泛，常用于测定细胞内各种细胞器Ca2+含量。
6.1 线粒体中[Ca2+]的测量
线粒体中Ca2+的测量可以直接进行或者可以根据细胞溶质指示剂Mn2+淬火法进行[14] 。 目前线粒体钙测量法中最为广泛应用的荧光指示剂为Rhod – 2[15]。在乙酰甲基(AM)酯的作用下，Rhod - 2带有移位的正电荷，可以使该指示剂在线粒体中优先累积。 在脱酯作用之后，指示剂散落在线粒体中，并且在线粒体囊腔中显示有Ca2+浓度。
Rizzuto等首先成功的将生物发光蛋白质-水母荧光素定位线粒体中的Ca2+[16]。 利用定位线粒体Ca2+的指示剂(mtAQE)发现在血管壁内皮细胞内存在大量的Ca2+，并且线粒体Ca2+的浓度迅速发生变化。 定位线粒体外叶的水母荧光素显示，在以肌醇三磷酸（IP3）介导的从内质网释放的Ca2+过程中，相对于其它细胞溶质来说，线粒体更易于接收到较高的Ca2+信号 [17]。 这表明在两个细胞器之间有钙转移优先发生。 Montero等人[18]使用了带有不同亲合性的定位线粒体的水母荧光素 ，并且和不同类型的荧光素发光底物腔肠素重新组合，能够测量很大线性范围的2+Ca浓度。 近年来，科学家开始用人工荧光蛋白Cameleons 、pericams以及camgaroos来进行Ca2+的浓度测量。此类研究方法以相应的cameleons为基础表现出线粒体指示剂的定位以及对钙的敏感程度。此外该研究还使用新型工艺，在内质网和线粒体内产生有关Ca2+循环的在概念方面的重要消息[19]。Rodolf[20]等在生理条件下用指示剂cameleon对骨骼肌中的Ca2+进行测量。此方法使用了双光子显微技术,解决了线粒体中迅速发生的Ca2+浓度变化，并使其变化具有特异性。Ca2+的浓度变化发生在活体内肌肉收缩和单肌颤搐期间。
6.2 内质网中[Ca2+]的测定
内质网是Ca2+释放的重要细胞器，其管腔内PH为中性且具有明确的蛋白保留信号。内质网所含的Ca2+已经成功的被所有类型的光学钙离子探针（包含具有生物发光性的水母荧光素、人工荧光蛋白以及低分子量的荧光指示剂）在内质网的管腔内所捕捉到。Nicholas等[21]通过研究发现应用光学钙离子探针能够很成功的快速定位和固定内质网内的钙离子。这种方法相比之前的探针方法有了很大的改进。Cameleon蛋白的荧光共振能量转移效率不会影响钙离子的生理浓度。新型cameleon具有适合内质网Ca2+测量的解离常数（Kd）值，并且具有合理的动态范围。 将钙网硬蛋白信号序列以及内质网保留信号（KDEL)添加到Cameleon Design 1(D1)中，从而形成以内质网Ca2+为目标的cameleon(D1ER)版本。 Palmer等[22]指出D1ER在内质网钙测量的敏感度方面提供了相当大的改善，要比以往的人工荧光蛋白cameleon YC4.3ER要优越。D1ER与Fura – 2的完美结合，可以用来同步测量各种比例的细胞溶质和内质网Ca2+。
Hofer等人[23]最早使用截留低分子量钙指示剂的内质网Ca2+测量方法。低亲合性钙指示剂Mag - Fura - 2的乙酰甲基(AM)酯在胞液和胞内间隔中积累。 细胞溶质的指示剂随后通过洋地黄皂苷经由质膜选择性渗透释放出来，将截留细胞器的指示剂留在“最重要的位置”作为主要的荧光作用的促成因素。Park等[24]使用整体单元形状贴片夹具方法用来除去细胞溶质的指示剂。 此法可以在内质网的细胞腔中对Ca2+浓度进行记录并保存质膜的完整性，使人们对随Ca2+而变的液流进行观察、对经由贴片吸量管传递的具有高亲合性Ca2+指示剂的细胞溶质钙浓度进行测量，并且可以对通过存储运转渠道的液流进行记录。
90年代初，Kendall等人最早开始尝试研究可用于内质网Ca2+测量的水母荧光素[25]。 由于水母荧光素亲合性低，研究者尝试不同类型的荧光素发光底物腔肠素。通过研究和方法的改进，使得该技术可以用于内质网钙的测量。Alvarez[26]等通过方法改良以及半合成技术研究出水母发光蛋白嵌合体，能够适合于在肌浆网细胞腔中对钙进行测量。
6.3内体(endosome)以及溶酶体中[Ca2+]的测量
Ca2+在内体以及溶酶体运输过程中具有重要作用。Ca2+指示剂BAPTA可以快速与细胞溶质内的Ca2+进行螯合，从而可以抑制初级内体的融合作用[27]。Pryor等[28]研究发现一些Ca2+
指示剂还可以抑制次级内体与溶酶体酶的运输小泡的融合作用。 Gerasimenko 等[29]使用低亲合性钙指示剂Oregon Green 488 BAPTA - 5N测量内体中Ca2+的浓度，此指示剂在初级内体中具有一定程度的耐酸性。研究发现初级内体的Ca2+浓度相对较低（3-30iM），Ca2+损失与细胞器酸化有密切关系。Christensen等[30]使用 Fura - 2右旋糖苷以及Oregon Green BAPTA - 1右旋糖酐指示剂测定Ca2+，发现来自内体的Ca2+的溢出可能参与细胞器早期的酸化作用。次级内体以及溶酶体的Ca2+浓度远远超过初级内体的Ca2+浓度。
进一步研究发现次级内体以及溶酶体的相对较高的Ca2+浓度需要细胞器内的蛋白具有一定的酸性pH值。 加入扰乱溶酶体的酸性因子可以导致细胞器蛋白内Ca2+的急剧减少。 这说明只要细胞器的酸性化程度充分，H+/ Ca2+交换便可能积累相当数量的Ca2+并且可以作为细胞器的Ca2+信号源[31]。
6.4细胞核内[Ca2+]的测量
Ca2+离子在细胞核的生命进程中具有重要调节作用，包括基因表达, DNA复制、蛋白的磷酸化作用，细胞周期和细胞凋亡的调节作用[32]。 外部核膜与内质网（ER)膜极其相似，事实上它是内质网薄膜的延长部分。 核膜的胞腔与内质网相连接，而内部核膜的成分与外部的核膜是非常不同的。 细胞核通过内质网型Ca2+ -ATP酶积累Ca2+。 核膜包含钙结合蛋白钙网硬蛋白以及钙释放渠道InsP3Rs 和兰尼碱(RyR)受体[33]。 细胞核是一种十分大的细胞器，可以通过荧光Ca2+敏感指示剂和共聚焦显微技术术与细胞质区分出来。 目前低分子量指示剂广泛用来测定Ca2+并比较细胞核与细胞质中Ca2+的信号差异[34]。
Miyawaki等使用细胞核定位信号，将具有荧光性的Ca2+感应蛋白cameleon定位到细胞核中[35]。 改良的cameleon降低了对pH的敏感度，其镶嵌于具有特异性的神经元表达序列被成功的引入到下丘脑部分神经元中，这一过程显示Ca2+在细胞核和细胞质调节方面存在着一定的差异[36]。 Nagai[37]等使用pericam指示剂来监测Ca2+在人子宫颈癌传代细胞的细胞核中的浓度变化，并且对线粒体初期Ca2+变化进行比较。pericam指示剂还被用于与细胞质和线粒体指示剂相结合的心肌细胞中，该研究显示了细胞区室中的同步Ca2+震荡过程[38]。 7总结
我们通过对组织和细胞内Ca2+ 浓度的动态监测与准确测定能更深入的认识许多生理和病理过程，对与Ca2+参与的相关药物作用机制的研究有极其重要意义。Ca2+ 测定方法不同，同种方法所用的指示剂又不尽相同。但每种测定方法都有其独特的优点，因此实验前应根据个人的实验目的仔细选择正确、简便、经济的检测方法，以及合理并现有的指示剂与信号检测仪。通过严谨科学的实验设计，以最终获得成功的实验结果。
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