CentralSouth
Pharmacy.March2009,V01.7No.3中南药学2009年3月第7卷第3期
脂质体包封率的测定方法
邵红霞1”,奉建芳2”,龙晓英1’(1.广东药学院,广州510006;2.上海医药工业研究院,上海200437l
中医药大学,上海201203)
3.上海
关键词:脂质体;包封率中图分类号:R943
文献标识码:B
文章编号:1672-2981(2009)03-0212—04
脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊。脂质体的包封率是包封于脂质体中的药物量占脂质体系中药物总量的百分比。也有人用测定包封体积来表征脂质体的包封特性。包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标之一,也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒特点的关键[1]。因此,研究脂质体时,包封率是一个重要的考察项目。包封率的测定方法一般是先用一定的方法(如柱层析法、透析法、超速离心法等)把未包封的游离药物与脂质体分离开并进行测定后,根据总投药量计算得出。或分离后测定包封于脂质体内的药物量与磷脂的比例,计算药脂比。本文综述了近年来脂质体包封率的测定方法。1分子排阻色谱法
分子排阻色谱是利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离,较广泛地用于测定脂质体的包封率。分子排阻色谱常用的分离介质是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶,把其装入柱子中分离游离药物与脂质体,故也称为凝胶柱法或柱层析法。其基本方法是先将溶胀好的凝胶装入柱子中,用洗脱液冲洗柱子至平衡后,将脂质体上柱,洗脱。脂质体由于粒径较大先被洗脱下来,而游离的药物粒径较小,渗透到凝胶的内部空隙,较后被洗脱下来,使得脂质体与游离药物分开。
高晓黎等[2]用3种不同型号的葡聚糖凝胶,采用正交设计法,对测定替加氟脂质体包封率的条件进行了筛选,实验结果表明葡聚糖凝胶的径高比、洗脱流速、上样量都影响脂质体与游离药物的分离效果,且3种凝胶中以粒径为100~
300
・min-1,用PBS洗脱,收集40流份,每份0.5mL,脂质体在9~12管流出,第10管的浓度最大。游离药物从第14管开始流出。主要集中在15~17管,因此能够分离脂质体和游离药物。作者还考查了药物和脂质体在柱子中的回收率,脂质体的柱回收率约为85%,其损失的15%可能是由于一些聚集的大粒径脂质体被截留在柱的顶端没有洗脱下来。
2微柱离心法
由于葡聚糖凝胶柱法在分离脂质体与游离药物时洗脱液对脂质体进行了大量的稀释,这可能导致脂质体的渗漏,从而使测定的包封率不准确,故在葡聚糖凝胶柱法的基础上,Fry提出了微柱离心法。基本步骤[5]是:①首先把溶胀好的凝胶装入去塞加滤板的注射器中,在一定的条件下离心,去掉离心液,制备干燥的凝胶小柱;②将样品加入小柱的顶部,离心,使脂质体离心下来;③用洗脱液多次离心洗脱把游离的药物离心下来。这种方法的优点是在最初的离心中已除去增加脂质体体积的过量空白溶液,因此不经稀释即可重新得到脂质体。但是该法是建立于脂质体不被填充物物理滞留的假设之上,应事先检验该假设。
王汀【6】等用微柱离心一药脂比法测定脂质体的包封率。首先用1mL的注射器装入葡聚糖凝胶G50制备离心小柱,然后考查了小柱对脂质体药物的分离作用和影响因素,实验证明不同的药物性质,可能造成脂质体与游离药物分离不完全,离心条件不同洗脱程度不同,最后采用测定药脂比计算包封率。在作者所考查的三种性质不同药物[亲水性盐酸拓扑替康(TPT)、亲脂性氟吡咯芬(FPF)、亲水亲脂性酮洛芬(KPF)]、相同脂质组成的脂质体中,凝胶对性质相似的不同药物的吸附作用并不相同,使用前必须考查使用条件。秦晶等L73用微柱离心法测定了阿魏酸脂质体的包封率研究中发现,离心转速对微型凝胶柱的分离能力有很大影响,转速过高或过低均容易引起凝胶柱的断裂,且转速过高会减小阿魏酸的洗脱体积。从而导致脂质体和游离药物分离效果不好。除了用葡聚糖凝胶制备离心小柱外,张乐乐【8J用阳离子交换树脂制备离心小柱,测定羟基喜树碱长循环脂质体的包
*通讯
tan的SephadexG50最适于脂质体包封率的测定。
PellequerY等[3]用带有蠕动泵系统的SephadexG75柱分离
脂质体和游离药物白细胞介素一2,所用的柱长为27ctn,流速为0.05mL・rain~,洗脱液为枸橼酸缓冲液,上样前先用空白脂质体饱和凝胶,之后用荧光法测定游离药物与包在脂质体中的药物,算出包封率。用空白脂质体预先饱和凝胶的目的是为了消除凝胶对脂质体的吸附作用。Manojlovic
V
等[41用凝胶柱分离游离的槲寄生凝集素(ML)和包封在脂质体内的MI,,所用的柱子为300mmX8n-fin,流速为1n儿
作者简介:邵红霞,女,硕士研究生,主要从事药物制剂,Tel:(021)55514600-111,E-mail:sha0274415@yahoo.corn.cn
作者:龙晓英,女。教授,硕士生导师,主要从事新剂型及新技术的研究,Tel:(020)39352559,Fax;(020)39352559,E-mail:longxy3156@163.com.
翟戮堂l司万方数据
中南药学2009年3月第7卷第3期CentralSouthPharrnacy.March2009,V01.7No.3
封率。具体方法是将处理好的树脂装入注射器中,上样后用纯水洗脱,游离药物吸附在阳离子树脂上不能洗脱下来,而脂质体被洗脱下来,接取定量洗脱液,与总药量相比,计算包封率。3透析法
透析法测包封率分为透析法和反透析法鼹种。透析法是把药物放入一定截留分子量的透析袋中,再把透析袋置于比它体积大许多倍的透析介质中,游离药物顺浓度梯度从透析袋内渗透到透析袋外,而脂质体由于粒径较大而不能渗透到外部介质里。然后在不同的时间测定介质中的药物浓度,直至外部介质中的药物浓度不变,则说明透析袋内外游离药物的浓度相同,达到平衡,此时的时间作为游离药物透析平衡时间。测出此时介质中的药物浓度计算游离药物的浓度,进而计算出包封率。
MuraP等[9]用透析法测定了苯佐卡因脂质体的包封率,3mL的苯佐卡因脂质体放入截留分子量为12000的透析袋中,把透析袋放入150mL水一乙醇(50:50)溶液介质中,并在转速为30r・min-1的磁力搅拌下透析,于不同的时间取样并补充等量的透析介质,直至取样的浓度恒定停止取样,用总的药物浓度减去分散到介质中的最终药物浓度作为包封在脂质体内的药物浓度,算出药物的包封率。FocoA等[10]用透析法测定SAP脂质体的包封率,样品放入截流分子量为10000的透析袋中,蒸馏水作为外部介质,先透析4h,更换透析液,透析24h后,取出透析袋内的样品计算包封的药物量,用未透析的样品计算总的药物量,两者之比为包封率。
在透析过程中外部介质对脂质体周围的游离药物稀释倍数较大,这可能会破坏脂质体与游离药物的动态平衡,使得包在脂质体中的药物渗漏出来;透析法一般使用的时间比较长,透析过程中由于脂质体的不稳定性也可能产生渗漏。但所用的透析袋价格比较便宜,且用量较少。比较经济。
反透析法是将制备的脂质体放在透析袋外,透析袋内放入透析介质。测定不同时间透析袋内药物的浓度的方法。用反透析法测定时,脂质体周围的游离药物稀释倍数较小,可以较好地避免冈脂质体与游离药物动态平衡被打破所导致的渗漏问题…】。郑莹等【123用反透析法研究了尼莫地平纳米脂质体的包封率,所考查的反透析游离药物的回收率符合要求,方法可行,用等渗的透析介质反透析6h,测得游离药物浓度,算出3次平均包封率为85.69%士3.31%,方法重现性好。徐云龙等L13J用反透析法测定阿霉素纳米脂质体的包封率,用PBS缓冲液稀释的脂质体作为外液,PBS液作为内液,恒温4℃、每间隔30min搅拌1次的条件下透析
6
h,每间隔一定时间从内液中取样,测定所取内液的吸光
度计算游离药物浓度,计算pH敏感阿霉素纳米脂质体的包封率。张伟光等[14]在用反透析法测定阿奇霉素脂质体的包封率时,选择15%的乙醇水溶液作为透析介质,透析介质稀释的脂质体作为外液,透析6h,分离未包封的阿奇霉素和脂质体,求算包封率。4离心法
根据脂质体与游离药物比重不同所受到的离心力不同,
万
方数据从而沉降速度不同,达到分离的目的,用来测定包封率。用离心法测定包封率分为超速离心和低速离心两种。
ZhangJA等[15]采用超速离心法评价羟基喜树碱脂质体
的包封率,取一定量稀释4倍的脂质体放人L一90K型超速离心管中,在4℃条件下,200
000r・min叫离心2
h,分离
游离药物与脂质体,以未离心前的样品计算总药物量,离心后的上清液为游离药物量,计算包封率。LafidiR等[16j在20℃条件下,85
000
r・min_1超速离心lh,并用去离子水
洗涤2次,合并离心的滤出液用于测定游离药物的量,用破乳剂破坏脂质体释放出包封的药物,包封的药物量比包封药物与游离药物的和,计算得包封率。陆伟根等[17]采用低速离心的条件,测定草乌甲素多囊脂质体的包封率,作者考察了离心强度对包封率的影响,最终选用的转速为600
r・
min_1离心5min。用离心后的上清液测定游离药物浓度,计算包封率。ChimanukaB等[18]用离心法测定哥蒿甲醚脂质体的包封率中。将脂质体水溶液2
500
r・“n一1离心20
min,取上清液测定,得游离药物的量,脂质体用乙腈破乳后同条件离心,取上清液测定,得总的药物量,从而计算包封率。
超速离心法测包封率时转速比较高,对温度有一定的要求,故对离心机的要求比较高;且超速离心和稀释都可能导致渗漏。但低速离心仅适用于一些粒径比较大的脂质体。5超滤离心法
如果脂质体与游离药物的粒径大小无重叠,可以用超滤离心法分离,超滤离心法很适用于分离水溶性药物【l9。。测定方法是将一定量脂质体放入特定的超滤管中,再把超滤管放入配套的离心管中,一定转速下离心一段时间,滤过的离心液用来测定游离药物的浓度,用未过滤的样品测定总药物浓度,计算包封率[2ff22]。超滤离心所用的离心管一般是一次性的,所以这种方法的成本较高。
超滤需要预先考查超滤膜对药物的吸附和对脂质体的截留情况。雷国锋等[23】用超滤法测定灯盏花素脂质体的包封率,其药物在超滤膜中的回收率大于95%,超滤膜对脂质体能够完全截留,脂质体不经稀释可直接测定,所用样品量少,证明超滤法测包封率简单、快速、重现性好。TeshimaM等[削采用超滤和凝胶柱2种方法测定脂质体的包封率,考察药物在脂质体内的滞留情况,发现用凝胶柱法测得的氢化泼尼松(PLS)脂质体的包封率比用超滤法降低了很多,而用这两种方法测棕榈酰氢化泼尼松脂质体的包封率没有显著不同,从而证明在凝胶柱中随着洗脱液的洗脱,脂质体被稀释,PLS会从稀释的脂质体中渗漏出来,而超滤法是测定脂质体包封率快速、简便的方法,且制备脂质体后可以迅速测定包封率。6离子交换色谱法
离子交换色谱法是根据游离药物与脂质体所带电荷的不同而分离。AmselemS等【250将阳离子交换树脂加入到所制备的脂质体中,室温振摇20min,未包封的阿霉素带正电荷,结合到阳离子交换树脂上,脂质体带负电荷不与阳离子交换树脂结合,过滤混合的脂质体和阳离子交换树脂使两者.分离,从而得到去除游离药物的脂质体。王绍宁等[26]根据
匿量域互
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药物带正电荷,脂质体不带电荷的特性,分离盐酸环丙沙星和脂质体。其中阳离子交换树脂对脂质体无吸附,游离药物全部被吸附,达到脂质体与游离药物的完全分离。结合一阶导数分光光度法测包封率。尹鸿萍等田1根据螺旋藻酸性多糖带负电的性质,采用阴离子树脂吸附分离,结合分光光度法进行脂质体包封率的测定。所考察的树脂对脂质体无吸附,对药物完全吸附,基本达到分离脂质体和游离药物的目的。
7鱼精蛋白凝聚法
将一定量的脂质体和鱼精蛋白溶液快速混和,脂质体与鱼精蛋白产生凝聚,通过过滤或离心,分离上清液(或滤液)和凝聚物,测出I:清液(或滤液)中的药物浓度为游离药物的浓度,聚集物中的药物浓度为包在脂质体中的药物浓度,计算包封率。
Rosier
RN等f28]研究蛋白质和多熔素与小囊泡的凝聚情
况表明,加入蛋白质后,能与囊泡迅速发生凝聚,一般30
s
内能够凝聚完全,对于磷脂囊泡,一般20S凝聚完全。在一定情况下,加入多熔素凝聚容易导致脂质体的渗漏,而蛋白质与脂质体凝聚后渗漏小。在所进行的各种实验条件下,加入蛋白质后的前几分钟内,渗漏率没有明显的增加。由于在这个时问内足以用过滤的方法分离脂质体和游离药物,所以蛋白质凝聚一过滤技术是分离混悬液和小囊泡的可选方法。这种方法分离快速,完全,渗漏低,费用低。GunterKKE29]等在蛋门质一脂质体的凝聚体中加入一定量的肝磷脂,经过涡旋或研磨,能够使凝聚体重新分散开,再过凝胶柱,可以将脂质体与蛋白质和肝磷脂分开,可以再回收用凝聚法测包封率的脂质体。孙维彤∞】等用鲑鱼精蛋白凝聚脂质体和纳米脂质体的研究表明,对于不同粒径的脂质体,通过调节鱼精蛋白用量可较准确的测定脂溶性药物脂质体的包封率,它适合小分子药物及正电荷大分子药物脂质体的分离。其局限性足脂质体的Zeta电位对鱼精蛋白凝聚法测定脂质体的包封率有一定影响,由于碱性氨基酸的存在,此法不适合负电荷大分子药物脂质体的分离。
以上所述测定包封率的方法是先把游离药物与脂质体分离开之后再测定包封率,由于这些方法具有一定的缺点,如凝胶色谱和离心能引起脂质体的渗漏,透析法透析不完全等,故许多文献报道了不分离脂质体与游离药物,直接测定脂质体包封率的方法,如NMR、荧光法、电子自旋共振法等。
8
NMR法
Zhang
XM等[31]建立了NMR法测定脂质体的包封率,
在跨膜pH梯度的存在下,用pH敏感的质子化学漂移试剂做标记物,通过调节脂质体外相介质的pH,利用不同pH值下的游离药物和包封的药物的共振信号的位移不同,来识别脂质体包封和未包封的药物峰,测定脂质体的包封率。测定过程小需要物理分离,是一种测定脂质体包封率快捷简便的方法。HintonDP等[32]用根据蔗糖的1H-NMR峰的位置与游离和包封的蔗糖相对应、且锋面积与游离和包封的蔗糖量相关的性质,用NMR法测定脂质体的包封率。9荧光法
j。~I?214鼍
万
方数据OkuN等[333根据钙黄绿素是荧光素的螯合剂衍生物、
可与CC十或Cu2+结合产生荧光淬灭的性质,用荧光法测定了钙黄绿素脂质体的包封体积。具体方法是先测定脂质体溶液中总的钙黄绿素荧光强度,之后在测定溶液中加入COCIz,C02+与未包封的钙黄绿素结合,产生荧光淬灭,此时测定的荧光强度为包封在脂质体中的钙黄绿素的荧光强度,计算包封率。这种方法快速、简单、准确。Wang
T
等L34]也用这种方法结合离心法测定脂质体的包封率,先用冻干剂的水溶液将脂质体稀释50倍,取稀释的脂质体分别在加入C02+前后测定荧光强度确定游离和包封的钙黄绿素浓度,计算包封率。
lO电子自旋共振法(ESR)
VistnesAI等[35]采用电子白旋共振法测定脂质体的包
封体积,通过加入电子自旋共振标记物TEMPONE(可自由渗透到脂质体的内部)和谱线展宽试剂草酸铬盐(不能渗透到脂质体的内部)来实现测定游离和包封的TEMPONE,当加入草酸铬盐时,包入脂质体内部的TEMPONE自旋共振谱线没有变化,而游离的TEMPONE谱线发生显著的展宽现象,从而可以测定包封和未包封的TEMPONE,计算包封率。
目前较多的文献报道了将游离药物进行一定的分离后,测定药脂比来表述脂质体的包封特性。王汀等[6]根据微柱离心法不能将某些游离药物和脂质体完全分离的性质,先把游离药物进行分离,之后测定药脂比(定磷法测定磷脂的量),来测定脂质体的包封率。RaimonS等[36]制备磁性脂质体后,用分子排阻色谱法分离游离药物,测定磁与磷脂的比例考察对磁包封情况。
脂质体包封率的测定方法较多,但不是每一种方法都适合所有的脂质体,故在考察脂质体的包封率时,只有通过理论和试验选择合适的测定方法,测出的包封率才更有意义。
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脂质体包封率的测定方法
作者:作者单位:
邵红霞, 奉建芳, 龙晓英
邵红霞(广东药学院,广州,510006;上海医药工业研究院,上海,200437), 奉建芳(上海医药工业研究院,上海,200437;上海中医药大学,上海,201203), 龙晓英(广东药学院,广州,510006)
中南药学
CENTRAL SOUTH PHARMACY2009,7(3)1次
刊名:英文刊名:年,卷(期):被引用次数:
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