第四节:凝胶蛋白质点的酶解
一. 蛋白质点酶解
准备工作：
1． 检查冻干机，调好水浴锅（37℃，56℃）
2． 检查各种试剂的量是否足够（DTT IAA NH 4HCO 3）
3． 检查酶解房卫生状况
每一步注意事项：
1．每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管
2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来
3. 每次打开EP 管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。
4．在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。
酶解前配制
1）、100 mmol/L的NH 4HCO 3
参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO 3 溶于10mL 水中
以后每一步25 mmol/L的NH 4HCO 3可用100 mmol/L的NH 4HCO 3稀释。
2）、1mol/L的DTT
参考配制10ML 称1.55gDTT 溶于10 mL 水中，1mL 分装，避光贮存（锡箔包），-20度永久保存
酶解步骤: 调水浴锅到37℃以便做脱色用，此外，调水浴锅到57℃，以便做还原用。
1. 冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，
2. 脱色：用含有25mmol/L 的NH 4HCO 3的50%的乙腈37℃保温30min 。如第一次脱色不完全可再脱一次
3. 干燥：吸出液体后，先加50%乙腈，再加100%的乙腈 。
4．还原：加入还原剂，封口，57℃水浴一小时，还原蛋白质。
还原剂：25mmol/L的NH 4HCO 3（含10mmol/L DTT）
参考配制方法（4mL ）：6.2mgDTT 溶于4mL 25mmol/L的NH 4HCO 3中
注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。
2．水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造成不必要的失误。
5．烷基化 将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基化试剂室温暗处放置45min ，使之碘乙酰胺化。
烷基化试剂：25 mmol/L的NH 4HCO 3（含55 mmol/L IAA）
参考配制方法（4mL ）：40.69mg IAA溶于4mL 25 mmol/L的NH 4HCO 3中 注意事项: 1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处，并记住放入顺序和时间，以便取出时按时间顺序处理。
2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再做后续实验。
6． 反应完成后去掉液体，依次用25mmol/L的NH 4HCO 3溶液，50%的乙腈，100%的乙腈冲洗胶块，每次振荡后放置10min ，去掉液体。
7．重复6的操作。
8．去掉液体后，用封口膜封口，扎孔，冻干30min ，注意该步要完全冻干, 这对蛋白质点的酶解很重要。（乙腈效果好可不需此步）
9. 酶解 每管加入适量（约25ul ）的酶液（切胶仪切的胶块每管加4uL 酶液），冰上放置30min(吸胀就好，时间自己控制) 。
取20uL 1mM HCl加入Trypsin 酶中，得1ug/uL的原液, 按2uL 每管分装
每2uL 酶液用98uL 覆盖液（10%乙腈，25mmol/L的NH 4HCO 3）稀释到
0.02ug/uL（即20ug 酶稀释到1ml ），现用现配。
参考覆盖液配制（2mL ）100mmol/L NH4HCO 3 500uL
100%乙腈 200 uL
双蒸水 1.3mL
注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上。
10．检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则再加
入适量酶液。
11．加覆盖液80uL 封口，37℃保温16-18小时。
蛋白质酶解后样品的提取
1. 将样品从37度水浴锅中取出后，1%终止酶解。10000 g/1 min.
2. 将上清转移到干净的EP 管中。
3. 在剩余胶块中加入萃取液（2.5 % TFA ,67% ACN for MALDI ,5% Formic Acid 67% ACN for ESI ）,37%保温30min 。
4. 超声15min ，间隔5min 重复超声 15 min 。水温不超过40度。
5. 10000 g/1min，合并上清。
6. 冷冻离心干燥至2-5 ul供质谱检测。
二. 银染蛋白质点酶解
准备工作：
4． 检查冻干机，水浴锅能否正常使用
5． 检查各种试剂的量是否足够
6． 检查酶解房卫生状况
每一步注意事项：
1．每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管
2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和震荡在管壁上的液滴甩下来
3. 每次打开EP 管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。
4．在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。
酶解前配制100 mM的NH 4HCO 3
参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO 3 溶于10mL 水中
以后每一步25 mM的NH 4HCO 3可用100 mM的NH 4HCO 3一份，加3份水稀释。
酶解步骤：
1. 水洗：用双蒸水洗银染以后的胶, 摇床上洗2-3次, 每次10分钟
2. 成像，取点 （如果还没有成像的话，以及用自动取点仪操作时，但一般情况下，胶是做完后便要扫描的）
3. 脱色，水洗
脱色工作液：30mmol/L K3Fe(CN)6 : 100mmol/L Na2S 2O 3=1:1
参考配制方法（4mL ）：2 mL 30mmol/L K3Fe(CN)6（称19.8g K3Fe(CN)6溶于2ml 便配成30mM 的溶液）：2mL 100 mmol/L Na 2S 2O （Amersham 公司银染试剂盒中的5％Na 2S 2O 331mL
加1mL 双蒸水）
注意事项：每次加5个样，加完脱色液后震荡，置白纸上观察，颜色脱去后马上加水200ul 冲洗停止反应，震荡， 2分钟内吸出，再加200ul 水，震荡，直到完全洗掉脱色液颜色（胶变得透明）。
4. 加入50%乙腈，震荡，洗1-2遍，每次15min
5. 脱水：100%乙腈脱水至胶块变成白色，若震荡后一次反应胶块没有变白，可将乙腈吸出，再加入100%乙腈脱水一次。
6. 吸胀：加入25mM 的NH 4HCO 3震荡后静置吸胀5min ，再吸出。
7. 脱水：同步骤5
8. 冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干机中冻干20min, 取出时轻敲EP 管底，其中白色胶块在管中轻快跳跃即可。
注意事项：注意冻干机靠右边的按钮打到“Low ”一档，在操作过程中有不小心把该挡碰到“High ”一档的现象，所以离开前一定要检查
调水浴锅到57℃，以便做还原时不用等。
9．还原： 加入还原剂，封口，57℃水浴一小时
还原剂：25mM 的NH 4HCO 3（含10mM DTT）
参考配制方法（4mL ）：6.2mgDTT 溶于4mL 25mM的NH 4HCO 3中
注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。
2．水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造成不必要的失误。
10．烷基化：从水浴锅取出样品后，室温冷却，去掉过量的液体，迅速加入同体积的烷基化试剂室温暗处放置30min.
烷基化试剂：25mM 的NH 4HCO 3（含55mM IAA）
参考配制方法（4mL ）：40.69mg IAA溶于4mL 25mM的NH 4HCO 3中
注意事项: 1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处，并记住放入顺序和时间，以便取出时按时间顺序处理。
2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再做后续实验。
11．终止烷基化反应，洗掉IAA
用25mM 的NH 4HCO 3洗胶块两次
12．脱水：同步骤5
13．吸胀：加入25mM 的NH 4HCO 3，震荡，静置5分钟，吸出。
14．脱水：同步骤5
15．冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干30分钟，注意该步要完全冻干。
16．加酶：每管加入适量的酶液（切胶仪切的胶块每管加4uL 酶液），冰上放置 30min
酶液的配制：将12M HCl稀释到1mM HCl,
稀释过程： 取20uL 1mM HCl加入酶中，得1ug/uL的原液, 按2uL 每管分装
每2uL 酶液用98uL 覆盖液（10%乙腈，25mM 的NH 4HCO 3）稀释到
0.02ug/uL
参考覆盖液配制（2mL ）100mM NH4HCO 3 500uL
100%乙腈 200 uL
双蒸水 1.3mL
注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上。
17．检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则加 入适量酶液。
18．加覆盖液20uL 封口，37℃保温16-18小时。
三. 蛋白质酶解后样品的提取
7. 将样品从37度水浴锅中取出后，10000 g/1 min.
8. 将上清转移到洗干净的EP 管中。
9. 在剩余胶块中加入萃取液（2.5 % TFA ,67% ACN for MALDI ,5% Formic Acid 67% ACN for ESI ）,37%保温30min 。
10. 超声15min ，间隔5min 重复超声 15 min 。水温不超过40度。
11. 10000 g/1min，合并上清。
12. 冷冻离心干燥至2-5 ul供质谱检测。