5.2.4 SNP技术及应用
概念：
Single Nucleotide Polymorphism，SNP，单核苷酸多态性。指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A,T,C和G）的突变引起的多态性变异。
一个SNP表示在基因组某各位点上有一个核苷酸的变化。
源于单个碱基的转换或颠换。转换占2/3左右，在CG序列上出现较多，多是C转换为T.
在人类基因组中，SNP 变异频率大于1 %, 每300∼1000 个碱基对就有一个SNP ,一个人至少携带3 00万个SNPs。
SSCP Analysis:S
ingle-Strand Conformation Polymorphism Analysis
A.
SSCP原理模式图
依据原理：单链DNA分子采用序列特异的构象。由单碱基替代引起的构象改变，可通过检测其在非变性聚丙烯酰胺胶中的迁移率的变化而捡出。
用途：
寻找和研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。是人类基因组计划的内容和目标之一。
法医学应用举例
SNP在未来医生开处方中的应用
5.2.5 基因敲除技术
概念：
gene knock-out,又称基因打靶。通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精确
的定点修饰和改造基因。
经典遗传学（Forward genetics）从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reverse genetics）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。
基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除两种。
•完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。
neor
tkHSV
基因X无突变
负选择标记基因表达，致死显微注射，将筛选之后的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔中，ES细胞是基因X敲除的杂合体，并且是黒毛纯合体，早期胚是白毛纯合体
来源于受体胚胎细胞，黑色区域来源于ES细胞
嵌合体小鼠与白毛纯合体小鼠回交
黑色后由ES细胞来源的种殖细胞（germ-line cell）发育而成，是被破坏基因X的杂合体
表型分析
5-11基因敲除的技术策略与步骤
•条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。
–Cre/LoxP系统
•Creis a 38 kDarecombinaseprotein from
bacteriophageP1 which mediates
intramolecular(excisiveor inversional) and
intermolecular (integrative) site specific
recombination between loxP
sites
•植物中：
–T-DNA插入失活
A
B
5-13植物基因敲除突变体植株的筛选。
A,
引物的设计。LP, RP分
别代表插入基因的左右两端引物，LB是指插入载体上的一段引
物。假定目的基因片断为900bp，Flanking sequence是测序测出的
一段序列。B, PCR电泳结果，分别代表了野生型、杂合子以及纯
合子的条带
Gene knock-in
1985年，利用同源重组将一段外源质粒p∆β117插入到人类染色体DNA β-珠蛋白位点，首次在哺乳动物细胞中进行基因打靶并获得成功。
在胚胎干细胞中进行同源重组已经成为遗传修饰小鼠染色体组基因位点的常规技术。
gene knock-out/ knock-in的特点：
•位点专一性强，打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传。
5.3 基因克隆技术简介
5.3.1 RACE 技术5.3.2 应用cDNA差示分析法克隆基因5.3.3 基因大规模克隆技术5.3.4 酵母单杂交法5.3.5 酵母双杂交系统5.3.6 基因的图位克隆法
克隆(clone)
•在多细胞的高等生物个体水平上，表示具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。同卵双生。
•细胞水平，由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。
•分子生物学，将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程。
分离真核生物目的基因片段
•通过由mRNA产生的cDNA进行克隆。
•cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
5.3.1 RACE技术
（rapid amplification of cDNAends）在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。
该方法Frohman等人1988年第一次提出．
已知cDNA序列来源：
•来自序列表达标签(EST)，减法cDNA库，差式显示和基因文库筛选。
应用：
•获得全长cDNA，还用于识别5’和3’端非转录序列，研究转录起始位点的不均一性，研究启动子区的保守性。
高质量总RNA的获得
1.获得高质量总RNA。
去磷酸化作用。带帽子结构的mRNA不受影响。去掉mRNA的5’帽子结构，加特异性RNA 寡聚接头并用RNA 连接酶
相连接。
以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶
的作用下，反转录合成第一条cDNA
链。
分别以第一链cDNA为模板进行
RACE反应。
5’RACE 以5’端RNA寡聚接头的部
分序列和基因特异的3’端反向引物
进行PCR扩增，获得基因的5’端序
列。
3’RACE以5’端基因特异的引物和3’端寡聚dT下游部分序列为引物进行PCR 扩增，获得基因的3’端序列。如果只对3’端序列感兴趣，可以越过2，3两步，直接从第4步开始进行
3’RACE。
6. 将纯化后的PCR产物克隆到载体
DNA中，进行序列分析。序列分析
cDNA差示分析法（Representational
Difference Analysis，RDA）
A technique to find differences in two genomic or cDNAsamples. Genomics or cDNAsequences from two samples are PCR amplified and differences analyzed using subtractive DNA hybridization.
1993年由冷泉港实验室建立。
原理：
•利用PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。
举例:选用开花后10天、棉花纤维伸长速度最快的陆地棉纤维及无长绒无短绒突变体胚珠作为起始材料，用改良的cDNA差示分析法筛选纤维伸长相关基因。
首先用PCR-Select cDNASubtraction方法获得纤维特异的cDNA减法库，每次随机挑取50个克隆测序，经14组700个序列分析表明该减法库中最多包含280-300个独立基因（表5-2）。
cDNA减法库随机序列分析结果
分组1-[**************]4总数成功序列数[***********]34143615独立基因数[***********]74280百分比（%）[***********]179
PCR扩增这些基因片段后用机械手点到尼龙膜上，再以纤维和胚珠RNA为探针进行杂交，分离到100多个新的纤维特异性或高表达基因（图5-16）。
纤维特异性或高表达的基因表达分析
5.3.3基因的大规模（高通量High
throughput）克隆技术
后基因组时代的需要推动此技术的产生。Gateway基因大规模克隆法利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，不需要传统的酶切连接过程，基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了
有力的技术平台。
A
Gateway克隆技术主要包括TOPO反应和LR反应。
••
TOPO反应。将通过PCR得到的目的基因连入Entry载体；LR反应。通过位点特异性重组将目的基因从Entry载体连入表达载体
B
Gateway 克隆技术小结
•通路克隆系统的最大特点：可以进行与宿主无关的克隆/亚克隆。
•首先，插入克隆与不同目标克隆在特异酶的识别下，分子内重组形成融合分子；•然后在第2次分子内反应中，该分子分解成2个子代分子，其中一个分子就是需要的表达载体。从而，插入载体中的外源基因亚克隆到了多个不同的目标载体中，形成各种不同的表达载体。
优点：
•反应时间短，表达载体生成百分率高。•用于构建表达载体非常方便快捷。
酵母单杂交体系
(Yeast One Hybrid system）
分析DNA－蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。
理论基础：酵母单
杂交体系的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
MBC 4thEdition Fig.9-35
质粒构建分为2部分：
1)将文库蛋白片段与GAL4 转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；
2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。
酵母单杂交原理示意图
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报道基因表达。若连接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图
阳性克隆（蓝色菌落）
At1g30210编码蛋白的激活活性鉴定（酵母显色）
1. 空载体pYF503+pG222，菌落为白色
2. pYF504(Gal4全长)+pG222，菌落为蓝色3. At1g53230 in
pYF503+pG222，菌落为白色4. At1g30210 in
pYF503+pG222，菌落为蓝色5. At1g30210 in pYF503+切去Gal4 Cis的pG222，菌落为白色
6. Ubiquitinin pYF503＋pG222，菌落为白色
应用：
1)确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。
2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA
结合位点蛋白的新基因；
3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的
DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。
Yeast Two-hybrid system
酵母双杂系统
研究蛋白质－蛋白质相互作用
理论基础：
通常转录激活因子（Transcription activator TA）必须包括两个结构域：AD－激活域和BD－DNA结合域
单独的DB能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
如果蛋白X和Y可以相互作用，就可以把与他们相连的AD和BD连接到一起，从而组成转录激活子
（TA），激活下游的报告基因的转录。因而通过报告基因是否转录来检测蛋白－蛋白之间的相互作用。
靶蛋白
DNA结合蛋白结合对象转录激活结构域蛋白质粒的构建过程：
‘bait’DNA 插入到含
有GAL4 BD DNA的质
粒载体中. 同样的方
法，‘hunter’DNA插
入到含有GAL4 AD
DNA的质粒载体中.
两种质粒共转化到酵
母菌株中，根据一定
的筛选标记，获得阳
性菌株。猎物诱饵把分别编码“诱饵”和“猎物”的重组基因引入酵母细胞酵母细胞捕获猎物诱饵报告基因的转录转录激活子结合位点报告基因表达的蛋白
图5-20 酵母双杂交技术原理图
5.3.7基因的图位克隆法
（Map-based cloning：walking）•是一种基于高分辨率遗传图谱分离突变基因的方法。
•从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。
•The strategy of map-based cloning is to find very closely linked to the gene of interest. Those molecular markers can serve as the starting point for chromosome walking or to the gene.
•首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
•其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。
•
然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
•人类基因组中，1cm≈1000kb；拟南芥菜中，1cm≈290kb；小麦中，1cm≈3500kb。
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)