VEGF―壳聚糖微囊复合缓释载体的制备

　　[摘要]目的：研究VEGF（vascular endothelial growth factor）-壳聚糖缓释微囊的制备工艺。方法：采用离子沉淀-凝聚法制备VEGF-壳聚糖缓释微囊，并检测其包封率和载药量。结果：实验制备的VEGF-壳聚糖缓释微囊包封率为87%，载药量为4.35%，微囊大小均匀，光洁度与成形度好。结论：本制备工艺方法简单易行，稳定，重现性好。说明利用天然高分子多糖类物质壳聚糖来包封VEGF是切实可行的，VEGF-壳聚糖缓释微囊具有进一步研究和应用价值。 　　[关键词]血管内皮生长因子；壳聚糖；微囊；载药量；包封率 　　[中图分类号]Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）22-0029-04 　　Abstract： Objective To investigate the preparation of VEGF-chitosan microcapsules. Methods VEGF-chitosan microcapsules were prepared by using of ion precipitation-coacervation method，and the drug loading and encapsulation efficiency were investigated. Results The microcapsules were in uniform size，good finish and shape，entrapment efficiency of 87%，drug loading of 4.35%. Conclusions The coagulation method is simple，stable and good reproducible.The results show that it is practicable to encapsulate VEGF by using of natural polymer polysaccharide chitosan.The VEGF-chitosan microcapsules have futher development and application value. 　　Key words：VEGF（vascular endothelial growth factor）；chitosan；microcapsules；drug loading； encapsulated efficency 　　在组织移植和创伤修复的过程中局部微循环的建立和充足的血供对提高移植组织的存活率、促进创伤的快速愈合具有重要作用。传统方法多采用直接添加外源性生长因子的手段，此种添加方式易造成其浓度仅一过性增高而难以形成长期稳定的有效浓度。研究表明，血管内皮生长因子是血管生成的重要因子，它促进血管内皮细胞的增殖，血管增生，延长血管内皮细胞的寿命以及增加血管通透性和血管维持作用[1-2]。外源性单纯局部供给VEGF往往利用率较低或较快代谢，影响了移植物的存活，因而研制一种能提高VEGF生物利用度的长效缓释制剂就显得尤为重要。 　　壳聚糖是一种无毒，无免疫抗原反应，可生物降解的天然高分子聚阳离子聚合物，具有pH响应性和良好的生物相容性及成膜性、且易于进行修饰[3-4]，可作为优良的药物控缓释及靶向载体，黏膜吸附剂、吸收促进剂等，是一种新型生物医学和药物传递应用材料[5]。 　　近年来，壳聚糖作为控释辅料在药物传递系统中得到了广泛的应用，曾见报道纳米微囊-VEGF复合体对创伤、慢性创面等的愈合影响研究[6-9]，但较少论及VEGF-壳聚糖缓释微囊具体制备方法及结果测试。本实验制备VEGF壳聚糖缓释微囊并检测其包封率、载药量和体外释放特征，旨在为VEGF-壳聚糖微囊复合缓释载体在相关研究中的应用提供依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　壳聚糖（sigma 448869）、吐温-80（Solarbio T8360）、硫酸钠（西陇化工股份有限公司）、冰醋酸（光东光华科技股份有限公司）、重组大鼠VEGF溶液（PEPROTECH 400-31）、大鼠VEGF ELISA试剂盒（欣博盛 ERC103）、PBS（Hyclone SH30256）；使用仪器有：移液枪、磁力搅拌器、超声波发生器、显微镜、离心机、电子天平、 冻干机、酶联免疫检测仪，恒温孵育箱、紫外分光光度计。 　　1.2 方法 　　1.2.1 制备空白壳聚糖微囊球：制作空白壳聚糖，用作VEGF载体。 　　1.2.1.1 微囊球溶解液：①2%冰醋酸溶液（2ml冰醋酸加双蒸水至100ml，pH值6.2）；②20%硫酸钠溶液（20克硫酸钠溶解到双蒸水中，定容至100ml）。 　　1.2.1.2 称取0.25g壳聚糖，用100ml 2%冰醋酸溶液溶解、磁力搅拌器搅拌20min。加入1ml吐温-80，磁力搅拌20min，滴加20%的硫酸钠溶液至溶液浑浊。 　　1.2.1.3 取少量溶液通过紫外分光光度计于500nm处检测其浊度来判定微球的形成。微球形成后继续磁力搅拌30min，超声波处理10min，转移到50ml离心管中，1 200rpm离心15min，上清液倒掉。重复“加入5ml双蒸水重悬，1 200rpm离心15min，上清液倒掉”3次。冷冻干燥，4℃保存。 　　1.2.2 制备VEGF壳聚糖微囊 　　1.2.2.1 溶液：①空白壳聚糖微囊溶解液；②2%冰醋酸溶液（2ml冰醋酸加双蒸水至100ml，pH值6.2）；③重组大鼠VEGF溶液（30?g VEGF溶于500μl双蒸水中）。 　　1.2.2.2 制备VEGF壳聚糖微囊：取1mg冷冻干燥的空白壳聚糖微球，用2ml醋酸缓冲液溶解，加入500?l（500?g）VEGF溶液。4℃条件下磁力搅拌60min，转入到15ml离心管。4℃，10 000～12 000rpm离心10min，收集上清液，为离心液。沉淀中加入1ml双蒸水，重悬。4℃，10 000～12 000rpm离心10min，收集上清液，为洗涤液。沉淀中加入1ml双蒸水，重悬。收集上清液，为洗涤液。沉淀中加入1ml双蒸水，重悬。将收集的上清液（离心液和洗涤液）收集合并为“合并液”共3.5ml，放入4℃冰箱备用。沉淀物冻干保存与-20℃备用。 　　1.2.3 VEGF壳聚糖微囊载药量及其包封率的测定 　　1.2.3.1 样品准备：将制备VEGF壳聚糖微囊时所收集的合并液用ELISA试剂盒中的标准品跟样品通用稀释液稀释1 000倍。 　　1.2.3.2 检测前准备工作：提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温；用双蒸水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液；标准品：加入标准品跟样品通用稀释液0.5ml至冻干标准品中，静止15min，待其充分溶解后，轻轻混匀（浓度为1 000pg/ml）。然后再进行梯度稀释，稀释后标准曲线使用浓度为1 000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.60pg/ml；生物素化抗体工作液：使用前20min，用生物素化抗体稀释液将30×的浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液；酶结合物工作液：使用前20min，用酶结合物稀释液将30×的浓缩酶结合物稀释成1×工作液。 　　1.2.3.3 测定吸光度：从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白孔加标准品标本通用稀释液，其余相应孔中加不同浓度标准品和待测样品 （100μl/孔），用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90min。提前20min准备生物素化抗体工作液。甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μl，静止30s后甩尽液体，在干净的吸水纸上排干，洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液（100μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60min。提前20min准备酶结合物工作液。避光室温（22～25℃）放置。洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液（100μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30min。打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。洗板5次。加入显色底物（TMB）100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15min。加入终止液100μl/孔， 混匀后即刻测量OD450值（3min内）。 　　1.2.4 计算包封率（%）和载药量（%）：根据标准品所测的OD值，得出标准曲线和标准曲线公式。包封率（%）=（投药量-合并液中药量）/投药量×100%，载药量（%）=（投药量-合并液中药量）/微囊重量×100% 　　1.2.5 VEGF壳聚糖微囊囊体外释放实验：取0.05mg VEGF-壳聚糖微囊，混悬于1ml PBS中，浓度为50μg/ml。37℃恒温下磁力搅拌30min。将搅拌好的VEGF-壳聚糖微囊用PBS进行梯度稀释，稀释梯度为10，102，103，104，105，稀释后VEGF-壳聚糖微囊的浓度分别为5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml、0.0005μg/ml。分别将5个梯度的VEGF-壳聚糖微囊溶液于24h、48h、72h、96h、120h时收集样品，每个样本收集500μl溶液。将收集的样品以10 000r/min离心15min，取上清液10μl，冻存于-20℃冰箱中。待120h后样品全部收集完成，ELISA检测其450nm处的OD值，根据所测样品OD值得出标准曲线公式（表3）及标准曲线（图4）。 　　2 结果 　　2.1 微囊500nm处的OD值 　　空白管OD值0.035，壳聚糖管OD值1.975，OD500nm=1.975-0.035=1.940。 　　2.2 微囊外观 　　在光学显微镜100倍下观察制的空白壳聚糖微囊（图1）和VEGF壳聚糖微囊（图2）。 　　2.3 VEGF壳聚糖微囊包封率（%）和载药量（%） 　　不同浓度标准品和待测样品（100μl/孔）OD450值见表1，标准曲线公式为：Y=0.00104X+0.0842，R2=0.999，VEGF壳聚糖微囊样品在450nm处的OD值为1.292、1.290、1.291，平均值为1.291，即公式中的Y=1.291，将1.291带入公式中得出X=1114（pg/ml），样品稀释倍数为1 000倍，合并液总体积为3.5ml，则3.5ml合并液中的VEGF量为：1.114X10-3×103×3.5=3.9μg，包封率=（30-3.9）/ 30×100%=87%，载药量=（30-3.9）/600×100%= 4.35%。标准曲线见图3。 　　2.5 VEGF壳聚糖微囊体外释放趋势 　　ELISA检测450nm处的OD值，得出标准曲线公式（表2）及标准曲线（图4）。根据标准曲线的线性回归方程，即可得出VEGF-壳聚糖微囊在PBS溶液中同一浓度不同时间药物释放趋势（图5）和同一时间不同浓度药物释放趋势曲线（图6）。 　　3 讨论 　　壳聚糖微囊包封药物有以下特点：①有明显的控制药物释放和延长药效的作用；②增加药物的靶向性；③降低所包封药物的毒副作用；④提高药物的稳定性；⑤提高疏水性药物对细胞膜的通透性。 　　本实验采用离子沉淀-凝聚法制备VEGF-壳聚糖缓释微囊，微囊在500nm处的OD值：空白管OD值0.035，壳聚糖管OD值1.975，OD500nm=1.975-0.035=1.940，即实验组（壳聚糖组）跟空白组（冰醋酸溶液跟硫酸钠溶液）相比，OD值明显升高，可见实验组已经形成了大量的壳聚糖微囊。在图1中，从A图和跟B图看出，超声波处理之后壳聚糖微囊大大降低了粘附程度，这样更有利于VEGF进入壳聚糖中。 　　载药量可直接影响临床用药剂量，而包封率则体现了制备工艺的优劣及制剂质量[10]。本实验所得的VEGF壳聚糖缓释微囊包封率尚好，为87%，表明本实验VEGF-壳聚糖缓释微囊制备工艺较好，原料利用率高，微球的球型度和光洁度也比较好。但载药量较低，为4.35%，预计可通过增加VEGF浓度加以提升，或者进一步寻求更利于提高载药量的方法。 　　从图5中可以看出：当VEGF壳聚糖微球的浓度相同时，随着时间的推移，VEGF是持续地从壳聚糖中释放出来，当释放到一定量时VEGF将不再释放，其中12～48hOD值变化较小，即VEGF的浓度变化较小，VEGF壳聚糖微球中的VEGF释放较慢，48～72hOD值变化较大，VEGF的浓度变化较大，及VEGF壳聚糖微球中的VEGF 释放较快，72～96hOD值变化又趋于平缓，VEGF壳聚糖微球中的VEGF缓慢释放。96h之后OD值几乎不再变化，即VEGF几乎不再释放。 　　图6显示：5个不同的浓度在24h之内OD值几乎不变化，即VEGF的浓度几乎没有变化，VEGF壳聚糖微球中的VEGF几乎不释放，48h之后VEGF壳聚糖微球浓度越高，所测OD值越大，即PBS溶液中VEGF浓度越高，即48h之后VEGF壳聚糖微球浓度越高，VEGF壳聚糖微球中的 VEGF释放越多。但当VEGF壳聚糖微球浓度稀释到1 000倍时，OD值变化缓慢，即VEGF释放缓慢。 　　壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为优良的药物控缓释及靶向载体，黏膜吸附剂、吸收促进剂，因此利用天然高分子多糖类物质壳聚糖包封VEGF是切实可行的。由于VEGF在血管生成过程中具有重要而广泛的活性，VEGF-壳聚糖缓释微囊作为新剂缓释载体，对细胞和组织等无毒性，能以适当速度被吸收降解，对VEGF有较高的包封率及稳定的缓释效果，因而具有很好的科研和临床应用前景。 　　[参考文献] 　　[1]Golocheikine A，Tiriveedhi V，Angaswamy N，et al.Cooperative signaling for angiogenesis and neovascularization by VEGF and HGF following islet transplantation[J].Transplantation，2010，90（7）：725 731. 　　[2]雷鸣，刘世清，刘宇兰，等.转染VEGF基因提高游离自体颗粒脂肪移植物存活率的实验研究[J].中华整形外科杂志，2008，24（1）：67-70. 　　[3]Zarzycki R，Modrzejewska Z.Use of chitosan in medicine and biomedical engineering[J].Polim Med，2003，33（1-2）：47-58. 　　[4]Jayakumar R，Prabaharan M，Nair SV，et al.Tamura H. 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