・48・・论著・
NGF与雌激素对离体培养的人头皮毛囊
影响的实验研究
杨壮群 屠军波 姚天华 赵小鸽
【摘要】 目的 观察神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)、雌激素(172)体培养人头皮毛囊生长的影响。方法 F、17E2尔,通过目镜测微器测量毛囊长度,利用3H2TdR(βngΠml)与米诺地尔(125μgΠml)1);而172E2(015μgΠml)()F(P>0105);3H2。结论 NGF(100ngΠml)与米诺地尔(125μgΠ
βml),而172E2(015ngΠml)则显示有抑制作用,NGF(100μβgΠml)可干预172E2(015μgΠml)抑制毛囊生长的影响。
【关键词】 毛囊 体外培养 神经生长因子 雌激素 米诺地尔
EffectsofNGFandestrogensonhumanhairfollicleinvitro YANGZhuang2qunhua,ZhaoXiao2ge.
3
3
,TUJun2bo,YAOTian2
DepartmentofOralandMaxillarySurgery,StomatologicalCollege,Xi′anJiaoTong
University,Xi′an 710004,China
【Abstract】 Objective ToobservetheeffectsofNGF,estrogensandminoxidilonthegrowthofhuman
hairfollicleinvitro.Methods Inamodelofhumanhairfollicleinvitro,thefolliclewasseparatelytreatedwiththeNGF,estrogensandminoxidil.Thegrowthofthehairfolliclewasmeasuredinlengthwithaneyepiecemi2crometer.TheeffectsoftheNGF,estrogensandminoxidilwereevaluatedbymeasuringtheratesofincorporationof3H2TdRofDNAsynthesis.Results Thegrowthofthehumanhairfolliclewasshowingsignificantlyfasterinthe100ngΠmlNGFand125μgΠmlminoxidilgroups,comparedwiththecontrol(P
βsignificantlyinhibitedinthe015μgΠml172E2group(P0105).Theratesofincor2
porationof3H2TdRinthegroupswereshownthattheresultsjustcorrelatedwiththeresultsoftheabove2men2tionedmethod.Conclusion The100ngΠmlNGFand125μgΠmlminoxidilcouldincreasethegrowthofhuman
βhairfolliclewhilethe015μgΠml172E2couldinhibitit.The100ngΠmlNGFcouldneutralizedtheeffectoftheβ015μgΠml172E2.
【Keywords】 Hairfollicle; Cultureinvitro; NGF; Estrogen; Minoxidil
毛发不但具有生物学和生理学功能,而且还有
心理学和社会学作用。多种生长因子和药物与毛囊生长和正常生长周期有关。神经营养因子的受体
NGFR
TrkA、TrkB、
TrkC和p75在毛囊形态发生中也有表[1]
达。在体内,雌激素能够通过增加细胞增殖率和推迟生长—退行期转化来延长头皮毛发生长周期。因此我们将神经生长因子(NGF)、雌激素和米诺地
作者单位:710004 西安,西安交通大学口腔医学院口腔颌面整形外科(杨壮群、屠军波),中心实验室(姚天华);西安交通大学医学院生物医学实验中心(赵小鸽)
尔应用于离体培养的人头皮毛囊模型,排除体内其它因素的干扰,也去除了毛囊周围其它细胞和基质的作用,旨在观察它们对离体培养毛囊的影响。1 材料与方法
111 标本来源 取自整形外科除皱头皮和神经外
科切口周边头皮(年龄18～45岁)。
112 主要仪器与试剂 仪器:医用净化工作台、细
胞培养箱、倒置显微镜、目镜测微器、解剖显微镜、冰冻切片机HM500O、液体闪烁记数器、显微外科器械。试剂:WillamsE无血清培养基(Giboco公司);
・49・
β谷氨酰胺、牛胰岛素、转铁蛋白、NGF、米诺地尔、172
3
E2(Sigma公司);H2TdR(北京原子能研究所)。113 离体人头皮毛囊培养 参照Philpott等
[2]
最终生长长度平均可达1～2mm。212 离体毛囊形态变化 倒置显微镜下观察毛囊生长主要表现为毛干与内外根鞘的延长,而结缔组织鞘则无明显的变化。毛囊内皮根鞘、外皮根鞘和结缔组织鞘层清晰,毛乳头和毛母质界线分明,呈锥形嵌入其中。毛囊生长末期,毛干与内皮根鞘之间的界限开始模糊不清,部分毛囊下段轻度弯曲。毛球与毛干上移,毛球形态不规则,毛根变成杵状,毛。
内皮根鞘、外皮根鞘(图1,2)。其中毛皮质呈灰,下部可见黑素颗粒;内根鞘细胞浆呈深红色;外根鞘细胞为多层,呈蓝紫色;结缔组织鞘和毛乳头呈淡红色。生长快的毛囊外根鞘柱状细胞层数较多,胞核颜色较深,毛乳头体积较大,而生长慢的毛囊外根鞘细胞为淡蓝色或淡红色,与内根鞘及结缔组织鞘的颜色相近。
方
法,将头皮标本置于无菌生理盐水中浸泡取回。在超净工作台中,清洗消毒后移入含有WillamsE无血清培养基的培养皿中,剪成约015cm宽的皮条。再用眼科剪刀从真皮和皮下组织交界处剪开,用显微外科镊顺毛囊方向将毛囊与周围组织钝分离,轻轻夹住毛囊远端小心从皮下组织中倒拔毛囊。注意不要伤及毛乳头和真皮组织鞘等组织,并小心去净毛囊周围的脂肪组织。
进行培养,孔1根毛囊,0mlE(配制的Williams,各成份的终浓度为:谷氨酰胺2mmolΠL,Hepes2mmolΠL,氢化可的松10μgΠL,转铁蛋白10mgΠL,亚硒酸钠10μgΠL,牛胰岛素10mgΠL,青霉素10×10UΠL,链霉素100mgΠL),37℃,5%CO2Π95%空气中悬浮培养,24h后选生长明显的毛囊(≥011mm)加入试剂继续培养,勿需换液。
114 实验分组 于成功培养的约200根毛囊中随
4
机取100根毛囊,分成下述5组:①空白对照组。②阳性对照组:加入米诺地尔125μgΠml。③NGF组:加入浓度为100ngΠml。④雌激素组:加入浓度为015μgΠml。⑤NGF与雌激素混合组:浓度分别为100ngΠml和015μgΠml,每组共20根。
115 毛囊形态观察与长度测量 每组随机取12根
图1 冰冻切片HE染色毛囊的五层结构(纵剖面) 图2 冰冻切片HE染色毛囊的五层结构(横断面)
毛囊,于倒置显微镜下观察毛乳头、真皮组织鞘、内皮根鞘、外皮根鞘及毛干的变化。以目镜测微器测量毛囊长度。选取部分正常培养的毛囊,以冰冻包埋剂(OCT)包埋,温度选择-21℃,横向和纵向作10μm厚的冰冻切片,HE染色。
116 H2TdR掺入与测定 每组6根毛囊,加入H2TdR使其终浓度为2μCiΠml,继续培养24h。取出
3
3
213 离体毛囊生长长度 在实验浓度下,NGF和米
诺地尔对离体培养的人头皮毛囊的生长有促进作用
(P0105),与雌激素组比较则有明显的拮抗抑制毛囊生长的作用(P
33-1
214 H2TdR摄入率 H2TdR摄入量以min
Π毛囊(R)表示,计算方法为:R=(每杯实测min-1值-本
-1
底min值)Π每杯毛囊数。阳性对照组和NGF组24和339100
-1
min,明显高于阴性对照组的237111min。说明在该浓度时,NGF和米诺地尔对离体的人头皮毛囊hH2TdR摄入量分别为418122min
-13
-1
毛囊,0101molΠLPBS冲洗3遍,置于闪烁杯中,加入2%乙酸200μl,70℃水浴至毛囊全部溶解,加入二氧六环闪烁剂6ml,液闪记数
。2 结果
211 离体培养的人头皮毛囊模型建立 经过第一
天的预培养有约80%的毛囊有不同程度的生长,筛选后用作实验。毛囊生长可持续10～15d,生长长度以前8d较为明显。而形态维持可达30d左右,
有促生长作用。而雌激素组为170156min,明显
低于阴性对照组,说明015μgΠml雌激素对离体培养
-1
・50・的人头皮毛囊生长有明显的抑制作用。NGF和雌激
3-1
素混合组24hH2TdR摄入量为301178min,明显
-1
高于015μgΠml雌激素组的170156min。说明100ngΠmlNGF可以拮抗015μgΠml雌激素对离体培养的人头皮毛囊生长的抑制作用。H2TdR掺入检测与长度检测结果完全一致。
表1 前8d各组毛囊生长变化
组别
2
40.4000.4230.4790.233350
60.4960.6450.64680.5630.7770.0.P105P雌
3
皮根鞘和毛乳头都存在雌激素受体(ER)。斑秃患
者皮损中,毛囊外皮根鞘ER显著增多,毛母质细胞出现ER阳性表达,而毛乳头中ER显著减少。说明病变的发生与ER在毛囊中的升高与分布有密切的
[6]
关系。Kondo等也发现雌激素与雄激素对试管内培养的人头皮毛囊有相同的生长抑制作用,与我们在本实验条件下的结果一致。其作用机制应排除体内免疫因素和血供营养因素的影响,可能是因为高(EGFR)水,生长期毛囊呈现退行,或。
NGF与雌激素之间的相互作用在神经元中研究
[7]
培养后时间(d)
P值
阴性对照阴性对照
NGF
0.2540.2000.2330.158雌激素
NGF与雌激素
P雌代表“NGF与雌激素组”与“单纯的雌激素组”比较的概率
3 讨论
国内外学者在动物或人的体外毛囊培养中也发
[3]
现米诺地尔在一定浓度范围内促进毛囊的生长。多年来人们通过体内实验也已证实米诺地尔对毛发生长的促进作用明显,具体机制可能与米诺地尔直接促进细胞增殖、开放钾离子通道、增加皮下血流、增加毛乳头VEGF表达及激活前列腺素内过氧化物
[4]
酶(PGHS)等因素有关。我们在离体培养的毛囊模型中验证了米诺地尔的促毛发生长作用并用该组作为阳性对照。
毛囊的神经分布呈周期性变化从另一个侧面提示了神经对毛囊生长的调控作用,也从组织形态上证实神经与毛囊的生长有密切的关系。临床现象和实验研究表明神经对毛囊的作用机制可能有两种:一是通过调控毛囊周围的血管分布对毛囊营养进行调控;另一种就是皮肤神经通过分泌一些因子作用与毛囊,从而调控毛囊的增殖、分化和凋亡。在毛囊的形态发生中,NGF、NT3、NT4和BDNF都有表达。最近就有研究表明NGFmRNA和它的翻译产物在生长期羊毛囊中有表达,位于增生的毛球部及其上
[5]
方的分化细胞。同时,神经营养因子的受体Tr2
NGFR
kA、TrkB、TrkC和p75在毛囊形态发生中也有表达。我们的研究结果则证实了外源性NGF对离体培养的人头皮毛囊有明显的促生长作用。
毛囊是雌激素的靶器官,正常人头皮毛囊的外
较多。在成年大鼠感觉神经元及PC12细胞中观察到雌激素使NGF受体(trk)mRNA及蛋白表达上调。Toran认为雌激素和神经营养因子之间可能通过增强受体和配体的功能性、在信号转导水平或基因转录水平相互调节而影响各自的功能。因此,雌激素和神经营养因子在神经元的发育,防止细胞凋亡,维持神经元的功能和形态方面起相互协调和促进作用。二者在毛囊生长发育中的作用尚有待于进一步研究。
参
考
文
献
1 SariolaH.Theneurotrophicfactorsinnon2neuronaltissues.CellMolLife
Sci,2001,58:106121066.
2 PhilpottMP,GreenMR,KealeyT.Humanhairgrowthinvitro.JCell
Sci,1990,97(124):4632471.
3 代秀菊,涂平,秦俭,等.米诺地尔对培养人头皮毛囊生长的影响.
临床皮肤科杂志,2002,31:628.
4 Nippon.Hairgrowtheffectofminoxidil.YakurigakuZasshi,2002,119:
1672174.
5
YardleyG,RelfB,LakshmananJ,etal.ExpressionofnervegrowthfactormRNAanditstranslationproductsintheanagenhairfollicle.ExpDermatol,2000,9:2832289.
6 KondoS,HozumiY,AsoK.Organculturedofhumanscalphairfolli2culeseffectoftestosteroneandoestrogenonhairgrowth.ArchDermatolRes,1990,282:442.
7 MukkuVR,StanceLGM.Regulationofepidermalgrowthfactorreceptor
byestrogen.JBiochem,1985,260:982029824.
(收稿日期:2003205224)