热带作物学报2011，32（2）：364-371
ChineseJournalofTropicalCrops
荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用研究进展
叶庆亮1，曹建华2＊
1中国热带农业科学院科技信息研究所2农业部橡胶树生物学重点开放实验室
摘
要
海南儋州海南儋州
[1**********]7
中国热带农业科学院橡胶研究所
高等植物细胞中，液泡在各种细胞信号转导事件和形态建成中起着重要的作用。这一细胞内部结构在
分裂和分化期间其功能和形状不断地变化着。为分析这些连续的变化，绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，
GFP）及其他荧光蛋白活体标记技术普遍用来跟踪特异蛋白的定位及变动。为使液泡可视成像，有几种途径可用
来选择适当的荧光蛋白融合伴侣，如液泡膜内在蛋白和构造蛋白相关蛋白等就非常适合应用于液泡成像。此外，三维重建法在定位细胞内广为分布的细胞器时也不可或缺。同时，等值面表面模化过程对液泡膜成像也非常有用。本文综述液泡的结构、种类和功能，并概括各种融合的绿色荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用及其三维成像技术的研究进展。关键词
液泡；三维成像；绿色荧光蛋白
中图分类号
Q945文献标识码A
RecentProgressinLivingCellImagingofPlantVacuoleUsing
Fluorescent-proteinTransgenicLinesand
Three-dimensionalImaging
YEQingliang1,CAOJianhua2
1InstituteofScientificandTechnicalInformation,CATAS,Danzhou,Hainan571737,China
2RubberResearchInstitute/KeyLaboratoryofRubberBiology,MinistryofAgriculture,CATAS,Danzhou,Hainan571737,China
AbstractInhighplantcells,vacuolesplayimportantrolesinavarietyofcellularevents,includingcelldivision,morphogenesis,andsignaltransduction.Theseintracellularstructuresundergodynamicchangesintheirshapesandfunctionsduringcelldivisionanddifferentiation,andtoanalyzethesesequentialstructuralchanges,thevitallabelingtechnique,usingthegreen-fluorescentproteinorotherfluorescentproteins,hascommonlybeenusedtofollowthelocalizationandtranslocationofspecificproteins.Tovisualizevacuoles,thetonoplast-intrinsicproteinsandsyntaxin-relatedproteinsareavailableforselectingtheappropriatefluorescent-proteinfusionpartnerforvacuolarimaging.Inaddition,three-dimensionalreconstructionmethodsareindispensableforlocalizingthewidelydistributedorganelleswithinthecell.Themaximumintensityprojectionmethodissuitableforcytoskeletalstructures,whilecontour-basedsurfacemodelingpossessesmanyadvantagesforvacuolarmembranes.Inthisarticle,wesummarizetheplantvacuolesandtherecentprogressinlivingcellimagingoftheplantvacuolesusingvariousfusionswithgreen-fluorescentproteinsandthree-dimensionalimagingtechniques.KeywordsVacuole;Three-dimensionalimaging;Green-fluorescentprotein.doi10.3969/j.issn.1000-2561.2011.02.036
高等植物细胞中，液泡在植物的各种细胞信号转导事件中起着重要的作用。因为植物细胞在延伸和扩展时必须增加体积，这个过程主要由液泡吸水得以推动。而大部分植物细胞液泡在所有器官中都是最大的，通常占成熟组织细胞体积的90％以上[1-3]。植物细胞通过液泡进行渗透调节和水分吸引，产生膨胀压力，从而驱动细胞延伸生长。有报道指出，液泡丧失会导致形态建成失常和胚胎死亡[4]。因此，毫无疑问，液泡在植物细胞中是非常重要的。
至今，液泡在固定细胞中研究得非常多，通常采用免疫细胞化学技术，通过电子显微镜和荧光显微镜进行观察。尽管已有很多采用固定细胞研究液泡的报道，但其结构的快速变化未能被详细跟踪研究。近年，采用绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）标记蛋白已成为细胞生物学中普遍的研究方法，使得目标蛋白的动态组织随时间变化的观察研究成为可能。本文综述了液泡的结构、种类和功能，进而概括了近年来主要应用GFP融合蛋白和
收稿日期：2010-12-09修回日期：2011-01-13
基金项目：中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项资助（No.[1**********]11）；国家天然橡胶产业技术体系资助（No.CARS-34）。作者简介：叶庆亮（1974年—），男，助理研究员。研究方向：从事果树发育生理。*通讯作者：曹建华，E-mail:cjh1314521@126.com。
第２期
叶庆亮等：荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用研究进展-365-
3-D成像技术对植物液泡的研究，以深入了解植物
活体细胞中液泡的结构及其功能。
水分吸引主要发生在液泡里，液泡扩展时产生的膨胀压力驱动细胞延伸生长。因此，液泡在细胞生长和形态建成时有着非常重要的作用[15-16]。
中央大液泡具有多种多样的功能，对许多生理活动都是必需的，主要功能是维持渗透压和内环境的稳定、贮存代谢产物、隔离和排除异物、消化细胞质组分等。但中央大液泡主要是作为营养性液泡而发挥作用，与物质代谢有关，此类液泡膜上一般具有营养特异性液泡膜固有蛋白（TIP）[11]，其基本功能包括贮藏、消化、膨压维持、毒素复合物分隔以及色素合成等[18]。某些特殊细胞的液泡中贮存有起保护和信号作用的复合物，尤其是那些对植物生长意义重大的组织细胞如叶表皮细胞等[1]。
归纳起来，植物液泡功能主要有：转运物质、贮存和吸收、调节细胞水势、吞噬和消化、特异性识别和信号转导、参与能量及物质代谢等[1-2，6，19]。
1
1.1
植物液泡的结构、种类与功能
植物液泡的结构
液泡是植物细胞特有的、由单层膜包裹而成的
囊泡，起源于内质网或者高尔基体的小泡，是一种复杂的、动态的细胞器，起着多功能区室的作用，由组织在分化过程中逐渐产生[5]，随着细胞的生长，这些小液泡经历不断融合、自体吞噬和内吞等过程，最后形成植物细胞所特有的中央大液泡。大部分植物细胞中央大液泡在所有器官中都是最大的，而将细胞质和细胞核挤到细胞的周缘[1，6-7]。中央大液泡的形成是成熟植物细胞的典型标志之一，也是成熟的植物活细胞构造的显著特征[8-9]。
1.2植物液泡的种类
高等植物细胞在生化和结构上有几种明显不同
的液泡类型，可分为水解性液泡（LVs）和蛋白贮藏液泡（PSVs）[10]。也可根据界膜上液泡膜内在蛋白（TIPs）的不同来区分。成熟组织中，经常有水解性液泡和蛋白贮藏液泡融合成大型的中央液泡。植物液泡在形状、大小、内含物及功能上均有很大差异，从而表现出多种多样的形式，通常同一细胞内会出现多种类型的液泡[11-12]。根据现有的研究报道，通常把植物细胞内成熟液泡分为营养性和贮存性液泡，其中中央大液泡便是营养性液泡的特殊形式。中央大液泡存在于植物营养组织的大部分细胞中；贮藏性液泡则主要存在于种子和果实细胞中[13-14]。
虽然很多学者已证实了植物液泡在形态上各有不同，但普遍认为所有的液泡都有着共同的起源，属于同一家族。随着细胞分离技术、液泡成像技术以及GFP融合蛋白等分子探针的深入应用，已能对不同组织细胞中的液泡组分进行定性分析[15-16]。
2
荧光蛋白
1955年，Davenport和Nicol在太平洋里的维多利亚水母（Aequoreavictoria）中发现了荧光蛋白的生物发光现象[20]。自1962年首次发现水母体内的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）后[21]，人们完成了GFP分离纯化、发光机制、结构功能、
基因克隆和融合表达等研究，并作为标记蛋白或报告蛋白引入到生物学和生物工程研究中，获得了广泛应用[22-23]，并逐渐拓展至环境科学等其他领域[24]。
荧光蛋白具有良好的非外源因子依赖发光特性、无种属依赖性，并有很高的稳定性及对生物体无毒性等优点，非常便于进行实时活体观察；同其它众多报告基因相比，荧光蛋白分子量小，易融合，适于多种转化方式；此外，还可将目标基因和荧光蛋白基因的融合产物整合到染色体内，从而转代以获得稳定的细胞系[25]。该细胞系可广泛用于研究特定基因在正常发育过程中的动态变化，也可用于在外界刺激条件下观测特定蛋白质之间相互作用的时空变化。因其具有诸多无可替代的优点，荧光蛋白在遗传学、神经生物学、发育生物学、生物化学和细胞分子生物学等诸多学科中均已得到广泛应用。这些应用大致可分为两类，一是将荧光蛋白本身作为报告基因，以检测其荧光强度随时间和空间的变化；二是将荧光蛋白与其他目的蛋白质进行融合共表达，以此研究蛋白的功能。
为了增强GFP的应用效果并扩大其应用领域，不少研究者在研究过程中对GFP进行了改进[26-27]，并对荧光（蛋白）色做了大量拓广工作，如通过对GFP
1.3植物液泡的功能
植物液泡的结构各种各样，也具有相应于各结
构的功能。依生长发育阶段和环境条件，液泡在形状和功能方面展现着时空变化[1]。细胞液泡中含有大量无机物、有机酸和色素等，这些物质在需要时能重新回到代谢途径。液泡中除含有大量细胞代谢过程中的基本物质外，也含有与生态调节相关的物质，如花色素类、类黄酮和一系列细胞内自身合成的有毒化合物。这些物质代谢在维持细胞正常生命活动中起着重要作用，同时作为液泡膜内外物质特异性识别和运输的转运蛋白对于维持液泡正常功能也至关重要[9，17]。液泡化植物细胞中，渗透调节和
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热带作物学报第３２卷
进行随机和定点突变，获得了红移荧光蛋白，其优点在于可以减少背景自发荧光，也有利于对两种标记（如绿色与红色）进行同步追踪。同时也发现了其他的红移荧光蛋白，如丙酸细菌的尿卟啉原（III）甲基转移酶，可作为裂殖酵母、大肠杆菌和哺乳动物细胞基因表达的报告蛋白，在细胞内大量表达时产生明亮的红荧光。如今，这种红荧光蛋白在微生物学研究[28-30]和FRET（荧光共振能量转移）[31-33]技术中应用已较为广泛[34]。
至今，由GFP改造而成的变体以及GFP本身，已覆盖了从蓝色到黄色的光谱范围[35-38]。荧光蛋白已成为揭示生命奥秘和研究疾病机理不可或缺的工具。
而成熟组织中，经常有水解性液泡（LVs）或蛋白贮藏液泡（PSVs）融合成大型的中央液泡。这些液泡基本功能包括贮藏、消化、离子动态平衡、膨压维持、防御反应、色素合成和毒素复合物分隔等[18]。这种多功能已通过荧光蛋白标记研究得以证明，并且所有这些液泡的加工都需要不少类型的蛋白参与[70-71]。
为了探明液泡所具有的多种特性，迄今有很多报道称采用大量GFP标记蛋白和活体染料定位到液泡膜（VM）上和液泡腔中[72-73]。然而，荧光的定位和稳定性在GFP嵌合蛋白和染料间变化很大。在液泡、内质网和高尔基复合体中，将南瓜2S清蛋白单个肽和C端肽融合进GFP会导致依赖BY-2细胞转化培养时间的GFP荧光暂时积累[74]。为了标记酸性液泡，大麦aleurain前体N端区被融合了
3
植物液泡可视成像
近年来，已有众多关于应用荧光蛋白标记于微
GFP，并被瞬时在烟草原生质中表达。尽管这种嵌
合蛋白在酸性液泡中得到积累，荧光水平比非酸性液泡标记弱得多[75]。液泡标记的GFP荧光在黑暗条件下转基因的拟南芥植物液泡腔里已被稳定地观察到，但这种荧光在光照条件下会快速消失[76]。因此，蛋白水解活性和LVs低pH不利于GFP荧光的稳定性和定量化研究。很显然，此后的融合蛋白的设计影响了荧光的密度和持久性。
此外，为对活细胞进行液泡腔染色，有几种荧光染料已被使用过，包括萤光黄CH[77-78]、Alexa结核药[89]、2＇，7'-二-（2-羧乙基）-5（6）-羧基荧光素乙酰甲酯（BCECF）[80]和吖啶橙[81]等。由于这些染料可以对液泡腔进行染色，因而可能比较容易地确定液泡的内含物及其分布。另外，来自液泡腔的荧光趋向于保护和隐藏各种液泡内结构如跨膜带（TVS）。
为获取更多有关液泡的细微结构，可优先考虑采用VMs染色法。要想使GFP与VMs融合蛋白成像，就要设法使用能定位VM的蛋白，并设计这种融合蛋白，从而使GFP荧光可位于VMs细胞质侧。有些TIPs[83-86]和融合蛋白相关蛋白AtVam3p/SYP22[87]通过与GFP融合并使VMs成像可用来分析液泡结构。采用表达GFP-γ-TIP嵌合蛋白的突变体转基因品系，开展液泡生物合成突变体的筛选[83]。尽管两性苯乙烯基FM染料最近被用作VM标记[79，84-85]，但对于VMs却只有有限的几种活体染色法可用。植物细胞中，FM染料已知是通过细胞壁，然后从质膜上被整合入胞浆膜上，最后经由胞饮途径到达
管、肌纤丝和液泡的可视成像研究中。在活体微管（MTs）成像时，新近的研究进展主要在于GFP融合技术的应用，这些技术可根据GFP融合蛋白伴侣粗略地分为三类：微管相关蛋白（MAPs）、微管蛋白和正端跟踪蛋白（+TIPs）[39-48]；而在观察植物活细胞中的肌纤丝（AFs）的成像时，则采用微注射荧光鬼笔环肽，并应用嵌合蛋白（由GFP和肌蛋白结合域组成）进行实验[49-53]；KeisukeObara等人则采用荧光蛋白标记研究了活细胞经历导管分化时的一系列变化，结果表明，液泡破裂与程序化死亡（PCD）之间存在着一定的关联，也就是液泡的破裂可能会激发启动细胞的程序化死亡[54]。
而有关荧光蛋白标记应用于植物花粉管构造及其生长特性的研究也多有报道，因为这一技术的运用，使植物花粉管生长特性的研究取得巨大进展[55]。同样，南京农业大学梨工程技术研究中心也采用荧光蛋白标记这一新技术，研究证明了梨自交不亲和反应过程中，外源S-RNase进入活体花粉管细胞会引发了一系列程序化死亡的典型特征，如线粒体的破裂和核DNA的降解等[56]。目前，该中心正在着手进一步应用荧光蛋白标记技术以研究梨自交不亲和反应过程中活体花粉管内液泡破裂与程序化死亡之间的关系。
近年来，也有不少应用荧光蛋白标记的研究指出，液泡破裂与液泡加工酶[VacuolarProcessingEnzymes（VPEs）]之间存在着密切的关系。研究还发现，植物液泡加工酶VPEs既存在于种子的蛋白质贮藏液泡中[56-60]，也存在于营养组织的裂解性液泡中[61-62]。荧光标记结果显示，液泡加工酶VPEs的上调和下调直接关联着植物液泡程序化死亡的启动与否[63-69]。
VMs[88-90]。
有报道称通过建立一种转化BY-2细胞品系，稳定表达一种GFP-GFPAtVam3p/SYP22（BY-GV7）融合蛋白以及通FM4-64正端标记可将BY-2细胞
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叶庆亮等：荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用研究进展-367-
的VMs染色，并成功对整个有丝分裂期间的VMs进行时程观察（图1）[80，85]，结果清晰地区分了大的中
4三维成像技术在植物液泡可视成像中的应用
4.1
三维成像技术
通常说一个客观的世界是三维的，客观世界的三维图像通过某种技术把它记录下来然后处理、压缩再传输出去，显示出来，最终在人的大脑中再现客观世界的图像，这个过程就是三维成像技术的全过程。近年来，已不断有实验报道称三维重建可观察到复杂而动态的液泡结构[80-82，88，92-93]。
4.2三维成像技术在液泡可视成像中的应用
3-D重建对于弄清完整的液泡结构已是必不可
少的了，因为植物液泡通常比较大，甚或遍布整个细胞。目前已采用了3种类型的3-D重建方法：投影法[如最大密度投影（MIP）]、阈值法（如等面重建）和轮廓法。通过投影法所使用的共聚焦激光扫描显微镜观察到的可视部分已获取了许多3-D重建。由于MIP适合对细胞骨架成像，通过取自
A.从胞质分裂开始，液泡膜微管结构（TVMs）（如红色箭头所指）局限于细胞板和细胞核之间。而纤细的跨膜带（TVSs）（绿色箭头）渗透进入大型液泡。30min后，液泡膜微管结构消失，而跨膜带厚度增加。细胞核移离细胞板。60min后，细胞核从细胞板上分开，并被大型液泡包围。跨膜带数量也增加了。
CLSM可视部分的MIP方法已经重建了AFs图像。然而，尽管VMs的MIP图像能揭示液泡结构的复杂性[74，79]，但要评价来自MIP图像的液泡连贯性却较难。当MIP图中BY-2细胞大型液泡明显出现被
区室化[73，79]时，基于轮廓方法的表面重建证实这些液泡事实上是相互连接的[80]。
此外，起源于投影方法的旋转视图通常受制于几种人为因素，如条带模型等[94]。表面重建因此也是适合检测详细的液泡结构方法。也有报道描述了在拟南芥大的液泡中有一种独特的VM结构[82]。这种在液泡腔中被命名为球泡的球形结构形成于
B.BY-GV7细胞G1期大型液泡的3-D成像重建。1.输出的可视部分之一；2.最大密度投影图像。3-6.同一3-D模型的不同视角图像。颜色的深浅表示焦距的长短，Z轴蓝色部分为体表细胞的底部。箭头所指表示被TVSs穿透的液泡孔。
图1BY-GV7细胞从胞质分裂到G1期的系列成像图
（采自KutsunaandHasezawa2002
）
VMs的双层膜上。表面重建用来辨清通过透射电
央液泡和渗透进了液泡的TVSs。通过采用BCECF（用于液泡腔染色）和FM4-64（用于VM染色）双标记，薄的TVSs仅明显存在于FM4-64荧光图中[85]。TVSs的结构和数目在整个细胞周期过程中激烈地变化着：从后期的G2阶段到中期，TVSs数目减少了，液泡膜的微管结构出现在有丝分裂器周围，而在G1期的早期TVSs数目则增加了，而且TVSs扩大形成大的液泡[85]。TVMs相似物也在拟南芥分生组织细胞中被检测到[91]。近来，通过与FM1-43相联的VMs成像，观察到了TVSs的融合与裂解[92-93]，
镜获得的系列图像中的球泡结构。而且，在拟南芥中转基因表达GFP-At-Vam3p融合蛋白[88]的大液泡中VMs圆柱形类薄片结构，通过阈值法弄清了在表达BobTIP26-1-GFP融合蛋白的烟草悬浮细胞中
VMs球形结构的形成[95]。然而，这些阈值法与VM
联合成像时的确存在一些缺陷。由于阈值法依赖于同等荧光，例如荧光漂白后，强烈的不同类型荧光造成直接干扰并对3-D图像造成误差。虽然有荧光恢复技术，这样的强度补偿[96]，将部分地提高重建模型质量，结合阈值方法和VM图像进行定量分析仍然很困难。为克服这些限制，通过采用重建法，如采用基于轮廓法来分析VMs共聚焦图像。结果弄清了有丝分裂期间含有TVM液泡的3-D结构[80]，并证实了TVM是微管结构以连接两个大的液泡直到胞浆移动。此外，有报道称建立并扩展了重建运
TVSs动态变化将有助于细胞质、细胞核以及大型液泡的空间构形。由于TVS构成细胞质，进而形成大的液泡，TVS的移动性由各种因子决定，包括细胞质和液泡腔的粘性，VM的流动性和细胞骨架
的活性等。
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热带作物学报
[4]RojoE,
an
essential
gene
required
for
vacuole
第３２卷
GillmorCS,KovalevaV,etal.VacuoleLESS1is
formation
and
算法则，并发展到名为REANT软件包程序。采用
BY-GV7细胞联合REANT，可以研究质壁分离时
形态学和形态测量学等方面的变化[97]。结果证明液泡腔中VMs椭圆形结构的存在，并确定来源于
morphogenesisinArabidopsis[J].DevCell,2001,1:303-310.[5]BethkePC.JonesRL.Vacuolesandpre-vacuoleacompartments[J].
CurrOpinPlantBiology,2000,3（6）：469-475.
[6]TaizL.ThePlantvacuole[J]．JEXPBoil,1992,172：113-122．[7]艾伯茨,布[8]谬祥孺,陈
雷,约翰逊,等．基础细胞生物学[M]．赵寿元等形,刘小丽．植物液泡的形成及其功能[J]．细胞生
译,上海：上海科技出版社,2002：17-19．物学杂志,2002,24（2）：95-101.
TVSs。这些定量分析表明，椭圆形结果充当渗透压中VMs的蓄水池。与3-D重建技术相结合，液
泡可视成像对于阐明液泡结构的复杂性带来了极大希望。
[9]胡军瑜,王俊刚,张树珍,等．液泡膜转运蛋白结构与功能的研
5
结论与展望
植物是活的，植物液泡研究也应该是活的动态
究进展[J]．河南农业科学,2009,6：5-10.
[10]HermanEM,LarkinsBA.Proteinstoragebodiesandvacuoles[J].
PlantCell,1999,11:601-613.
[11]ParisN,StanleyCM,JonesRL,etal.Plantcellscontaint
wofunctionallydistinctvacuolarcompartments[J].Cell,1996,85:563-572.
[12]JauhGY,PhilipsTE,RogersJC.Tonoplastintrinsicprotein
isoformsasmarkersforvacuolarfunctions[J].PlantCell,1999,11:1867-1882.
[13]门中华,李生秀．高等植物液泡分离的研究进展[J]．西北植物学
报,2003,23（12）：2216-2222.
科学。因此，仅研究静态固定的植物液泡结构是远远不够的。充分发展并利用活体显微技术，广泛运用荧光蛋白等活体标记和观察技术，研究植物液泡完整的时空进程[98]，从而探索植物液泡中各类分子，乃至整个细胞和组织[99-100]，甚至整个植物体的动态变化，将在很大程度上促进我们对整个植物科学的认识[101-102]。
绿色荧光蛋白的发现及应用具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并在此基础上改造发展和发现了一系列荧光蛋白，拓展了应用范围。这使得对微观生物学的研究可以进入到一个时空结合、研究鲜活动态过程的新时代。
[14]LiaoXR,ChenT,LiuXL,etal．Theformandfunctionsof
plantvacuoles[J]．JournalCytobiology,2002,24（2）：95-101.[15]YonedaA,KutsunaN,HigakiY,etal.Recentprogressinliving
cellimagingofplantcytoskeletonandvacuoleusingfluorescent-proteintransgeniclinesandthree-dimensionalimaging[J].Protoplasma,2007,230:129-139.
[16]Webbma.Cell-mediatedcrystallizationofcalciumoxalatein
plants.PlantCell,1999,11:751-761.[17]强
胜．植物学[M]．北京：高等教育出版社,2006：29.
GFP及其衍生物是观察植物活细胞内成分非常
有效的工具，并一直被用于液泡的动态变化及其结构研究。有几种GFP融合伴侣可选用，且每一种有其自己的优缺点。作为液泡标记物，定位液泡的信号肽被用来标记液泡腔和一些TIPs以及构造蛋白相关蛋白作VM成像观察。此外，3-D重建对于分析大型结构如液泡等是一种很重要的工具。而选择适当的报告基因蛋白和成像方法也是非常必要的。
高等植物细胞中，液泡在某些细胞事件中起着重要的作用，并须相互协作。为扩大对植物活细胞中液泡特性的了解，用GFP色变和活体染料同时同步观测其结构就显得非常必要，诸如在用BY-
[18]DeDN.Plantcellvacuoles[M].CSIROPublishing,Collingwood,
Australia,2000:89-96.
[19]XiaZ,HengAO.Recentadvancesincultureofplant
protoplasts[J]．PlantPhysiologyCommunications,1989,（2）：1-6.[20]DavenportD,NicolJac.Luminescenceofhydromedusae[J].Proc
RSocLondonSerB,1955,144（916）：399-411.
[21]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY,etal．Extraction,purification
andpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J]．JCellCompPhysiol,1962,59：223-239.
[22]KendallJM,BadmintonMN.Aequoreavictoriabioluminescence
movesintoanexcitingnewtem[J]．TrendsinBiotechnology,1998,16（5）：216-224.
[23]刘默芳,王恩多．绿色荧光蛋白[J]．生物化学与生物物理进展,
2000,27（1）：238-243.
[24]叶海仁,钟卫鸿,陈建孟．绿色荧光蛋白分子标记在环境微生
物学研究中的应用[J]．环境污染与防治,2003,26（6）：353-355.
GF11细胞和FM4-64染料开展多色标记时，或在建立稳定的双重转化使MTs和AFs成像时等等。
至于要想知道更多详细的相关信息则可通过一些活体标记技术和三维分析方法以进行深入研究。
参考文献
[1]MartyF.Plantvacuoles[J].PlantCell,1999,11:587-599.[2]王[3]王
忠．植物生理学[M]．北京：中国农业出版社,2000：32.仁,薛绍白,柳惠图．细胞生物学[M]．2版,北京：北京师范
[25]钟卫鸿,陈建孟,陈[26]杨
伟,等．珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研
究和应用[J]．中国生物工程杂志,2005,25（5）：10-14．
广,Wang-Pruskigefu,龙民生．绿色荧光蛋白的改进[J]．农业生物技术学报,2002,10（4）：397-403.
[27]MartynovVI,MaksimovBI,MartynovaNY,etal．Apurple-bluechromo-proteinfromGonioporatenuidembelongstothe
大学出版社,1998：675-693.
第２期
叶庆亮等：荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用研究进展
2005,46:531-538.
-369-
DsRedsubfamilyofGFP-likeproteins[J]．JournalofBiologicalChemistry,2003,278（47）：46288-46292.
[28]MikkelsenL,SarroccoS,LubeckM,etal.Expressionofthe
redfluorescentproteinDsRed-ExpressinfilamentousascomycetefungiFEMS[J].MicrobiolLetters,2003,223（1）:135-139.[29]JakobsS,SubramaniamV,SchonleS,etal.EGFPandDsRed
expressingculturesofEscherichiacoliimagedbyconfocal,twophotonandfluorescencelifetimemicroscopy[J].FEBSletters,2000,479（3）:131-135.
[30]NancharaiahYV,WattiauP,WuertzS,etal.Duallabelingof
PseudomonasputidawithfluorescentproteinsforinsitumonitoringofconjugaltransferoftheTOLplasmid[J].AppliedEnvironmentMicrobiology,2003,69（8）:4846-4852.[31]王进军,陈小川,邢
06:980-984.[32]王进军,陈小川,邢
达．利用FRET技术在活细胞内观察EGF
对PKA作用的时空成像[J]．生物物理学报,2004,（02）:109-113.
达．FRET技术及其在蛋白质-蛋白质分
子相互作用研究中的应用[J]．生物化学与生物物理进展,2003,
[46]DixitR,ChangE,CyrR,etal.Establishmentofpolarity
during
organization
of
the
acentrosomal
plant
cortical
microtubulearray[J].MolBiolCell,2006,17:1298-1305.[47]OdaY,HasezawaS.Cytoskeletalorganizationduringxylemcell
differentiation[J].JPlantRes,2006,119:167-177.
[48]OdaY,MimuraT,HasezawaS.Regulationofsecondarycell
walldevelopmentbycorticalmicrotubulesduringtrachearyelementdifferentiationinArabidopsiscellsuspensions[J].PlantPhysiol,2005,137:1027-1036.
[49]SchmitAC,LambertAM.Microinjectedfluorescentphalloidin
invivorevealstheF-actindynamicsandassemblyinhigherplantmitoticcells[J].PlantCell,1990,2:129-138.
[50]YonedaAA,AkatsukaM,KumagaiF,etal.Disruptionofactin
microfilamentscausescorticalmicrotubuledisorganizationandextra-phragmoplastformationatM/G1interfaceinsynchronizedtobaccocells[J].PlantCellPhysiol,2004,45:761-769.[51]HolwegC,SusslinC,NickP.Capturinginvivodynamicsofthe
actincytoskeletonstimulatedbyauxinorlight[J].PlantCellPhysiol,2004,45:855-863.
[52]VoigtB,AntoniusCJT,JozefSamaja,etal.GFP-FABD2
fusionconstructallowsinvivovisualizationofthedynamicactincytoskeletoninallcellsofArabidopsisseedlings[J].EurJCellBiol,2005,84:595-608.
[53]SanoT,HigakiT,OdaY,etal.Appearanceofactinmicrofilament
‘twin
[33]EricksonMG.,MoonDL,YueDT.DsRedasapotential
FRETpartnerwithCFPandGFP[J].BiophysicsJournal,2003,85:599-611.[34]钟卫鸿,陈建孟,陈
伟,等．珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研
究和应用[J]．中国生物工程杂志,2005,25（5）:10-14.
[35]TsienRY,111egreenfluorescentprotein[J]．AnnuRevBiochem,
1998,67：509-544.
[36]HeimR,CubirAB,TsienRY.Improvedgreenfluorescence[J].
Nature,1995,373（6516）：663-664.
[37]ShanerNC,PattersonGH,DavidsonMW,etal.Advances
influorescentproteintechnology[J]．JCellSci,2007,120（24）：4247-4260.
[38]ShanerNC,SteinbachPA,TsienRY,etal.Aguidetochoosing
fluorescentproteins[J]．NatMethods,2005,2（12）：905-909.[39]ShiraNinio,JeanCelli,CraigR.RoyALegionellapneumophila
effectorsproteinencodedinaregionofgenomicplasticitybindstoDot/Icm-modifiedvacuoles[J].PLoSPathogens,2009,5（1）:121-124.
[40]GrangerCL,CryRJ.Microtubulereorganizationintobacco
BY-2cellsstablyexpressingGFP-MBD[J].Planta,2000,210:502-509.
[41]MaoG,ChanJ,CalderG,etal.ModulatedtargetingofGFP-AtMAP65-1tocentralspindlemicrotubulesduringdivision[J].PlantJ,2005,43:469-478；
[42]KorolevAV,ChanJ,NaldrettMJ,etal.Identificationofa
novelfamilyof70kDamicrotubule-associatedproteinsinArabidopsiscells[J].PlantJ,2005,42:547-555.
[43]KumagaiF,HasezawaS.Dynamicorganizationofmicrotubules
andmicrofilamentsduringcellcycleprogressioninhigherplantcells[J].PlantBiol,2000,3:4-16.
[44]KumagaiF,YonedaA,KutsunaN,etal.Dynamicbehaviorof
microtubulesandvacuolesatM/G1interfaceobservedinlivingtobaccoBY-2cells[J].BiotechnolAgricFor,2004,53:81-97.[45]YonedaA,AkatsukaM,HoshinoH,etal.Decisionofspindle
polesanddivisionplanebydoublepre-prophasebandsinaBY-2celllineexpressingGFP-tubulin[J].PlantCellPhysiol,
peaks’inmitosisandtheirfunctionincellplate
formation,asvisualizedintobaccoBY-2cellsexpressingGFPfibrin[J].PlantJ，2005，44:595-605.
[54]KeisukeObara,HideoKuriyama,HirooFukuda,etal.Direct
EvidenceofActiveandRapidNuclearDegradationTriggeredbyVacuoleRuptureduringProgrammedCellDeathinZinnia1[J].PlantPhysiology,2001,125,615-626.
[55]王春雷,张绍铃．荧光标记在植物花粉管构造及生长特性研究中
的应用[J].西北植物学报,2007,27（2）：0407-0413.
[56]ChunL,GuoHX,XeuTJ,etal.S-RNasetriggersmitochondrial
alterationandDNAdegradationintheincompatiblepollentubeofPyruspyrifoliainvitro[J].ThePlantJournal,2009,57:220-229.
[57]GuY,FuY,DowdP,etal.RhofamilyGTPasecontrolsactin
dynamicsandtipgrowthviatwocounteractingdownstreampathwaysinpollentubes[J].JCellBiol,2005,169:127-138.[58]MitsuhashiN,HayashiY,KoumotoY,etal.Anovelmembrane
proteinthatistransportedtoproteinstoragevacuolesviaprecursor-accumulatingvesicles[J].PlantCell,2001,13:2361-2372[59]RojoE,MartinR,CarterC,etal.Moonlightingvacuolar
protease:multiplejobsforabusyprotein[J].TrendsPlantSci,2005,10:516-518
[60]Yamadak,shimadat,kondoM,etal.Multiplefunctional
proteinsareproducedbycleavingAsn-Glnbondsofasingleprecursorbyvacuolarprocessingenzyme[J].JBiolChem,1999,274:2563-2570.
[61]KinoshitaT,YamadaK,HiraiwaN,etal.Vacuolarprocessing
enzymeisup-regulatedinthelyticvacuolesofvegetativetissuesduringsenescenceandundervariousstressedconditions[J].
-370-PlantJ,1999,19:43-53.
热带作物学报第３２卷
laserscanningmicroscopy[J].JExpBot,1995,40:417-423.[78]YanoK,MatsuiS,TsuchiyaT,etal.Contributionoftheplasma
membraneandcentralvacuoleintheformationofautolysosomesinculturedtobaccocells[J].PlantCellPhysiol,2003,45:951-957.[79]EmansN,ZimmermannS,FishcherR.Uptakeofafluorescent
markerinplantcellsissensitivetobrefeldinAandwortmannin[J].PlantCell,2002,14:71-86.
[80]KutsunaN,KumagaiUMF,SatoMH,etal.Three-dimensional
reconstruction
of
tubular
structure
of
vacuolar
membrane
throughoutmitosisinlivingtobaccocells[J].PlantCellPhysiol,2003,44:1045-1054.
[81]GaoXQ,LiCG,WeiPC,etal.Thedynamicchangesof
tonoplastsinguardcellsareimportantforstomatalmovementinViciafaba[J].PlantPhysiol,2005,139:1207-1216.[82]SatioC,UedaT,AbeH,etal.Acomplexandmobilestructure
formsadistinctsubregionwithinthecontinuousvacuolarmembraneinyoungcotyledonsofArabidopsis[J].PlantJ,2002,29:245-255.
[83]AvilaEL,ZouharJ,AgeeAE,etal.Toolstostudyplant
organellebiogenesisPointmutationlineswithdisruptedvacuolesandhigh-speedconfocalscreeningofgreenfluorescentprotein-taggedorganelles[J].PlantPhysiol,2003,133:1673-1676.[84]KimDH,EuYJ,YooCM,etal.Traffickingofphosphatidylinositol
3-phosphatefromthetrans-Golginetworktothecentralvacuoleinplantcells[J].PlantCell,2001,13:287-301.[85]Kutsuna,HasezawaS.Dynamicorganizationofvacuolarand
microtubulestructuresduringcellcycleprogressioninsynchronizedtobaccoBY-2cells[J].PlantCellPhysiol,2002,43:965-973.[86]ReisenD,Leborgne-castelN,OzalpC,etal.Expressionofa
cauliflowertonoplastaquaporintaggedwithGFPintobaccosuspensioncellscorrelateswithanincreaseincellsize[J].PlantMolBiol,2003,52:387-400.
[87]HicksGR,RojoE,HongS,etal.Germinatingpollenhas
tubularvacuoles,displayshighlydynamicvacuolebiogenesis,andrequiresVACUOLESS1forproperfunction[J].PlantPhysiol,2004,134:1227-1239.
[88]UemuraT,YoshimuraSH,TakeyasuK,etal.Vacuolarmembrane
dynamicsrevealedbyGFP-AtVam3fusionprotein[J].GenesCells,2002,7:743-753.
[89]BolteS,TalbotC,BoutteY,etal.FM-dyesasexperimental
probesfordissectingvesicletraffickinginlivingplantcells[J].JMicrosc,2004,314:159-173
[90]GelderN.Theplantendosomalsystem—itsstructureandrole
insignaltransductionandplantdevelopment[J].Planta,2004,219:547-560.
[91]AnientoF,RobinsonDG.Testingforendocytosisinplants[J].
Protoplasma,2005,226:3-11.
[92]Segui-SimarroJM,StaehelinLA.Cellcycle-dependentchanges
inGolgistacks,vacuoles,clathrin-coatedvesiclesandmulti-vesicularbodiesinmeristematiccellsofArabidopsisthaliana:aquantitativeandspatialanalysis[J].Planta,2006,223:223-236.[93]RuthardtN,GuldeN,SpiegelH,etal.Four-dimensional
imagingoftransvacuolarstranddynamicsintobaccoBY-2cells[J].Protoplasma,2005,225:205-215.
[62]HaraNI,HatsugaiN,NakauneS,etal.Vacuolarprocessing
enzyme:anexecutorofplantcelldeath[J].CurrOpinPlantBiol,2005,8:404-408.
[63]MauriceB,NatalieSP,RuthMP,etal.Characterizationofa
legumain/vacuolarprocessingenzymeandYVADaseactivityinPapaverpollen[J].PlantMolBiol,2010,74:381-393
[64]JamesBB,ErnestVG,MeihengY,etal.Polycationic
Nanoparticles:（1）SynthesisofaPolylysine-MIONConjugateanditsApplicationinLabelingFibroblasts[J].J.ofCardiovasc.Trans.Res,2009,2:30-38.
[65]NishiharaE,ShimmenT,SonobeS,etal.Newaspectsof
membranedynamicsofAmoebaproteuscontractilevacuolerevealedbyvitalstainingwithFM4-64[J].Protoplasma,2007,231:25-30.
[66]YonedaA,KutsunaN,HigakiT,etal.Recentprogressin
livingcellimagingofplantcytoskeletonandvacuoleusingfluorescent-proteintransgeniclinesandthree-dimensionalimaging[J].Protoplasma,2007,230:129-139.
[67]RohdeM,MayerH.Exocytoticprocessasanovelmodelfor
mineralizationbyosteoblastsinvitroandinvivodeterminedbyelectronmicroscopicanalysis[J].CalcifTissueInt,2007,80:323-336
[68]KazunoriH,YasushiI,MasayukiI,etal.MM2-thalamic-type
sporadicCreutzfeldt-Jakobdiseasewithwidespreadneocorticalpathology[J].ActaNeuropathol,2006,112:503-511.
[69]WheelerMJ,DeGraafBHJ,HadjiosifN,etal.Identificationof
thepollenself-incompatibilitydeterminantinPapaverrhoeas[J].Nature,2009,459:992-995.
[70]CarterC,PanS,ZpijarJ,etal.hevegetativevacuoleproteomeof
Arabidopsisthalianarevealspredictedandunexpectedproteins[J].PlantCell,2004,85-3303.
[71]MarkWS,IanA,SvetlanaGV,etal.Activationoftrypsinogen
inlargeendocyticvacuolesofpancreaticacinarcells.PNAS,2007,104（13）:5674-5679.
[72]YonedaA,KutsunaN,HasezawaS.Dynamicorganizationof
microtubulesandvacuolesvisualizedbyGFPinlivingplantcells[J].RecentResDevPlantMolBiol,2003,1:127-137.[73]BrandizziE,IronsSL,JohansenJ,etal.GFPisthewayto
glow:bio-imagingoftheplantmembranesystem[J].JMicrosc,2004,214:138-158.
[74]MitsuhashiN,ShimadaT,ManoS,etal.Characterizationof
organellesinthevacuolar-sortingpathwaybyvisualizationwithGFPintobaccoBY-2cells[J].PlantCellPhysiol,2000,41:993-1001.
[75]DiSansebastianoGP,ParisN,Mara-martinS,etal.Regeneration
ofalyticcentralvacuoleandofneutralperipheralvacuolescanbevisualizedbygreenfluorescentproteinstargetedtoeithertypeofvacuoles[J].PlantPhysiol,2001,126:78-86.[76]TamuraK,ShimadaT,OnoE,etal.Whygreenfluorescent
fusionproteinshavenotbeenobservedinthevacuolesofhigherplants[J].PlantJ,2003,35:545-555.
[77]HilimerS,QuaderH,Robert-nicoudM,etal.Luciferyellow
uptakeincellsandprotoplastsofDaucuscarotavisualizedby
第２期
叶庆亮等：荧光蛋白在植物活细胞液泡成像中的应用研究进展-371-
[94]ReisenD,MartyF,Leborgne-CastelN.Newinsightsintothe
tonoplastarchitectureofplantvacuolesandvacuolardynamicsduringosmoticstress[J].BMCPlantBiol,2005,5:13.[95]KutsunaN,HasezawaS.Morphometricalstudyofplantvacuolar
dynamicsinsinglecellsusingthree-dimensionalreconstructionfromopticalsections[J].MicroscResTech,2005,68:296-306.[96]SunY,RajwaB,RobinsonJP.Adaptiveimage-processing
techniqueandeffectivevisualizationofconfocalmicroscopyimages[J].MicroscResTech,2005,64:156-163.
[97]KutsunaN,HasezawaS.Morphometricalstudyofplantvacuolar
dynamicsinsinglecellsusingthree-dimensionalreconstructionfromopticalsections[J].MicroscResTech,2005,68:296-306.[98]WasteneysGO,YangZ.Newviewsontheplantcytoskeleton[J].
PlantPhysiol1,2004,36:3884-3891.
[99]ZhangD,WadsworthP,HeplerPK.Dynamicsofmicrofilaments
aresimilar,butdistinctfrommicrotubulesduringcytokinesisin
living,dividingplantcells[J].CellMotilCytoskeleton1993,24:151-155.
[100]YanoK,MatsuiS,TsuchiyaT,etal.Contributionoftheplasma
membraneandcentralvacuoleintheformationofautolysosomesinculturedtobaccocells[J].PlantCellPhysiol,2004,45:951-957.[101]ValsterAH,HeplerPK.Caffeineinhibitionofcytokinesis:
effectonthephragmoplastcytoskeletoninlivingTradescantiastamenhaircells[J].Protoplasma,1997,196:155-166.[102]VanDammeD,BougetFY,VanPouckeK,etal.Molecular
dissectionofplantcytokinesisandphragmoplaststructure:asurveyofGFP-taggedproteins[J].PlantJ,2004,40:386-398.
责任编辑：高静
《热带作物学报》征稿简则
本刊是我国热带作物领域的综合性学术期刊（从2009年起由双月刊变更为月刊），国内外公开发行。选登热带作物领域学术论文、研究报告、专题评述、学术问题讨论、研究简报（或快报）、成果摘要等稿件，欢迎踊跃投稿。
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符号和分子式。
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果。应说明测试仪器的型号、生产厂商、测试条件和精度；所用材料、试剂的纯度和纯化方法；所用的技术标准和方法，凡已见报道的实验，只需列出参考文献，实验注意事项应予注明。数据报道应注意有效值位数及精确度。
6文中图、表力求简明，插图一般不超过8幅，避免文、表、图互相重复。附表采用三线表，必要时
可加适当辅助横线。
7国际通用缩写词，可直接引用；非国际通用缩写词在文内第一次出现时应先写出中文名词，后在括
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8参考文献采用“顺序编码制”，择主要的列于文末。未公开发表资料不可收入参考文献，只能在正
文的“脚注”中予以说明。著录项目及其次序如下：
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名（外文可按标准缩写）.出版年，卷号或年号（期号）：参考部分的页次.
图
书：［序号］作者.书名[M].版次（第1版可不标）.出版地：出版者，出版年：参考部分的页次.论文集：［序号］作者.篇名[G].//文集编者ed.文集名.版本.出版地：出版者，出版年:参考部分的页次.专利文献：［序号］专利申请者.题名[P].其他责任者（供选择）.附注项（供选择）专利国别.专利文献种类专利号.日期.
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将酌收版面费；刊登后，酌情计发稿酬，并赠当期《热带作物学报》两册，需加印单行本的作者，请在来稿时注明（费用自理）。上述的稿酬、审稿费、版面费均为本刊印刷版、光盘版、网络版3种形式的总和。
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