园 艺 学 报 2011，38（1）：151–158 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com 大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定
冯大领1,2，石学萍1，杨 煜3，王彦华1，轩淑欣1，赵建军1，申书兴1,* （1河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001；3山东省农业科学院高新技术研究中心，济南 250100）
摘 要：以我国优良的大白菜自交系‘85-1’为材料，利用pIndigoBAC-5为载体，通过对高分子量
DNA 的制备、大片段DNA 的选择、连接转化条件等几个方面的优化，构建了大白菜细菌人工染色体文
库。该文库由57 600个克隆组成，平均大小为98.4 kb，空载率为1.5%；覆盖大白菜基因组10.3倍；挑
取6个克隆培养5 d后，经Hin d Ⅲ完全酶切检测，其指纹图谱稳定一致。大白菜细菌人工染色体文库的
构建为重要功能基因的克隆和定位及比较基因组研究奠定了基础。
关键词：大白菜；细菌人工染色体文库；插入片段；稳定性
中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X （2011）01-0151-08
Construction and Characterization of a Bacterial Artificial Chromosome Library from Chinese Cabbage
FENG Da-ling1,2，SHI Xue-ping1，YANG Yu3，WANG Yan-hua1，XUAN Shu-xin1，ZHAO Jian-jun1，and SHEN Shu-xing1,*
（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding ，Hebei 071001，China ；2College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding ，Hebei 071001，China ；3High-tech Research Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji ’nan 250100，China ）
Abstract ：A bacterial artificial chromosome library of Brassica campestris L. ssp. pekinensis （Lour. ）Olsson （Chinese cabbage）was constructed from inbred line‘85-1’with the vector pIndigoBAC-5. The key processes of the construction，such as preparation of high molecular weight DNA，selection of digested fragments ，condition of ligation and transformation，were studied. The library consists of 57 600 clones in which the average insert size is about 98.4 kb and the empty clones are about 1.5%. The library represents an equivalent of 10.3 fold size of Chinese cabbage genome. Six clones randomly picked from this library show no Hin d Ⅲ fingerprint changes after 5 days’ successive culture，which indicates that the clones in the library are stable. The library will lay the foundation for gene clone，location and comparative genomics research of Brassica .
Key words：Chinese cabbage；bacterial artificial chromosome library；insert fragment；stability
收稿日期：2010–08–23；修回日期：2010–12–20
基金项目：国家自然科学基金项目（30871713）；高等学校博士学科点专项科研基金（[1**********]001）；河北省自然科学基金项目（C2010000738）；河北省应用基础研究计划重点基础研究项目（08965514D ）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail ：shensx@hebau.edu.cn）
致谢：本试验得到了山东省农业科学院高新技术研究中心李广存博士以及河北农业大学王省芬教授、张娜博士的指导，在此表示感谢。
152 园 艺 学 报 38卷
构建基因组文库是从DNA 水平上对各种生物进行研究的技术平台，基因组文库是永久保存基因资源的最好方法，也是进行基因组结构和功能研究的基础。细菌人工染色体文库（Bacterial artificial chromosome library，BAC 文库）具有插入片段大、稳定性强、易于操作等优点，是应用最广泛的基因组文库。目前已经在多种植物中成功构建，如拟南芥（Choi et al.，1995）、水稻（彭开蔓 等，1998；Qiu et al.，1999；刘华清 等，2003）、菜豆（Vanhouten & MacKenzie，1999）、小麦（Ma et al.，2000；Chen et al.，2002）、玉米（Zhang et al.，2000；Yang et al.，2003）、甘蓝（Vicente & King ，2001；Gao et al.，2004）、棉花（王省芬 等，2006）、油菜（陈书元 等，2008）等。BAC 文库在基因的染色体物理定位、物理图谱构建、比较基因组研究、基因的图位克隆、基因组测序等方面发挥着重要作用。
大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis （Lour. ）Olsson ]是十字花科（Cruciferae ）芸薹属（Brassica ）植物，是我国乃至世界重要的蔬菜作物。自2003年成立多国芸薹属基因组计划以来，韩国和英国构建了白菜类作物A 基因组的BAC 文库（KBrH 、KBrB 、KBrS 、JBr ），并利用BAC 克隆末端测序进行了一系列结构基因组方面的研究（http ：//www. brassica. info；Bancroft ，2006）。Trick 等（2007）和Suwabe 等（2008）利用BAC 克隆末端测序进行了A 基因组的序列分析及甘蓝型油菜与白菜基因组遗传连锁图谱的整合。Park 等（2005）和Hong 等（2006）利用BAC 克隆开展了大白菜与拟南芥的比较基因组研究。Mun 等（2008）建立了基于大白菜BAC 克隆的第1张物理图谱。河北农业大学园艺学院蔬菜育种实验室多年来一直从事大白菜细胞、分子遗传及育种工作，创建了大白菜整套初级三体以及结球甘蓝—大白菜异附加系等多种遗传材料（申书兴 等，2006；张玉成，2008；顾爱侠 等，2009；张巍巍 等，2009）。由于大白菜和结球甘蓝均属于小染色体作物，普通的核型分析方法很难将异附加系中结球甘蓝和大白菜的全部染色体分辨出来。本研究中以具有我国特色的优良大白菜自交系为材料构建BAC 文库，为利用BAC-FISH 技术区分异附加系中外源染色体、定位和筛选优良的功能基因以及研究基因间互作与性状间的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为大白菜自交系‘85-1’，是包头品种类型的骨干亲本。该自交系叶色浅绿、叶帮白，叶球圆形，生长期70 d左右，抗病性强，配合力高。由河北农业大学园艺学院蔬菜育种实验室提供。
1.2 主要试剂及仪器
克隆载体采用Epicentre 公司的pIndigoBAC-5（Hin d Ⅲ-cloning ready）；感受态细胞采用Invitrogen 公司的DH10B 菌株；Hin d Ⅲ和T 4连接酶购自NEB 公司；精胺、亚精胺、蛋白酶K 、氯霉素购自Sigma 公司。 脉冲场电泳仪采用Bio-Rad CHEF-DRⅡ，电击转化仪采用Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ，冷冻离心机为Sigma 公司的3-16 PK。
1.3 BAC文库构建方法
1.3.1 高分子量基因组DNA 的提取
本提取方法按照Zhang 等（1996）和Ma 等（2000）方法并做改进。取培养12 ~ 15 d的大白菜真叶30 g用液氮浸泡研磨成粉末，迅速放在300 mL预冷的核离析液中（内含0.1% β–巯基乙醇 + 10% Triton-100），15 min后用微细滤布（Microcloth ）过滤到50 mL离心管中，4 ℃ 1 800 × g离心10 min，加5 mL核离析液悬浮细胞核，合并各离心管的溶液，4 ℃ 1 800 × g离心10 min，重复1
1期 冯大领等：大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定 153
次。加入不含β–巯基乙醇和Triton-100的核离析液1 mL。42 ℃水浴3 min，迅速加入等体积的1.5%低熔点琼脂糖（核离析液配制），轻轻混匀，加入胶块模具（Plug mold）中，冰上30 min，制备成胶块。将胶块放入含1 mg · mL-1蛋白酶K 的裂解液中，50 ℃水浴摇床中22 h，重复1次。将胶块置于30 mL含40 μg · mL-1苯甲基磺酰氟（PMSF ）的T 10E 10（10 mmol · L-1 Tris-HCl，10 mmol · L-1 EDTA ）中冰上2 h，重复1次。再将胶块放在不含PMSF 的T 10E 10中1 h清洗胶块，重复1次。随后将胶块置于0.5 mol · L-1 EDTA中4 ℃保存备用。
1.3.2 基因组DNA 的部分酶切及大片段DNA 的获得
起始脉冲5 s，选择最佳酶切条件之前，首先对胶块进行预电泳，预电泳条件为：电压4 V · cm-1，
终止脉冲5 s，脉冲时间4 h。用不同酶量[0.6 U、1.5 U、2.5 U、3.5 U、4.5 U、6.5 U（U 为酶活力单位：1个酶活力单位是在1 min内能转化1 μmol 底物的酶量）]的Hin d Ⅲ分别酶切半个胶块30 min，电泳检测最佳的酶切条件，脉冲电泳条件为：电压6 V · cm-1，起始脉冲50 s，终止脉冲50 s，脉冲时间16 h。选定最佳酶切条件后，对3个胶块进行大量酶切，酶切后采用2次脉冲电泳选择法获得目的片段。第1次选择100 ~ 300 kb之间的DNA ，用刀片切割下来，然后将此胶块分成两部分（100 ~ 200 kb，200 ~ 300 kb），进行第2次电泳，电泳后分别将DNA 胶块切割下来，通过电洗脱方法得到大片段DNA ，在TE 溶液中透析2 h。以不同浓度的λDNA 为对照，电泳估测大片段DNA 的浓度。
1.3.3 大片段DNA 与载体的连接转化
连接体系为：pIndigoBAC-5载体10 ng，部分酶切的大片段DNA100 ng，10 × buffer10 μL ，400 U T 4连接酶1 μL ，加ddH 2O 至100 μL ，16 ℃连接过夜。连接产物经TE 溶液中脱盐浓缩处理3 h。取10 μL 感受态细胞冰上备用，加连接产物2 μL ，进行电击转化。电击条件为：V = 14 kV · cm-1，Ω = 200，电容 = 25 μF 。转化液加入1 mL SOC培养基中，37 ℃ 225 r · min-1震荡培养箱中培养1 h。在含有氯霉素（12.5 μg · mL-1）的LB 培养基上培养过夜。检测克隆的插入片段情况，挑取覆盖基因组约10倍的克隆储存在含冻存液的384孔板中，–80 ℃保存。
1.4 BAC文库的质量检测
挑取200个克隆，经摇菌培养，按照碱裂解法提取质粒，Not Ⅰ酶切检测插入片段的大小、空载率。随机挑取6个克隆，继代培养5 d，分别取培养1、3、5 d的菌液提取质粒，37 ℃ Hin d Ⅲ完全酶切，根据酶切的指纹图谱检测克隆的稳定性。
2 结果与分析
2.1 高分子量基因组DNA 的质量检测
胶块经裂解及含PMSF 的TE 处理后，脉冲场电泳检测胶块中DNA 的质量。由图1可以看出，
图1 高分子量DNA 的检测
Fig. 1 Determination of high moleculor weight DNA
M ：Marker.
154 园 艺 学 报 38
卷 1/2胶块、1/4胶块、1/8胶块均含有亮带，其DNA 片段大小集中在700 kb以上，且降解较少，能够满足试验的要求。
2.2 最佳酶切条件的选择
对DNA 进行部分酶切时受两方面的影响，一是酶浓度，二是酶切时间。本试验的酶切时间固定为30 min，主要对酶切浓度进行选择。由图2可以看出酶的用量在1.5 U和2.5 U时，酶切片段集中在100 ~ 300 kb之间，这正是需要的目的片段。随着酶用量的增高，酶切片段越来越小，当酶用量达到6.5 U时，片段集中在150 kb以下，不能满足试验需要。因此，对DNA 进行大量酶切时选用1.5 ~ 2.5 U的酶用量，37 ℃，酶切30 min。
图2 最佳酶切条件的确定
Hin d Ⅲ 酶用量单位：U 。
Fig. 2 Determination of optimal partial digestion conditions
Unit of Hin d Ⅲ enzyme：U.
2.3 大片段DNA 的获得
经过第1次选择，切下100 ~ 300 kb的目的片段。将第1次切下的胶块横切分成100 ~ 200 kb和200 ~ 300 kb两个胶块，继续电泳。电泳后的DNA 很集中，对回收有利。
用电洗脱的方法将DNA 从第2次选择后切下的胶块中洗脱下来。经不同浓度的未酶切的λDNA 电泳检测，DNA 片段浓度为4 ~ 6 ng · μL -1，能够满足连接的需要。
2.4 DNA与载体的连接转化
100 ~ 200 kb和200 ~ 300 kb DNA与载体的连接均按照质量比10︰1的比例连接16 h。转化后经涂板培养得知，100 ~ 200 kb的DNA 转化效率较高，1次转化2 μL 连接产物得到5 000个左右的克隆，而200 ~ 300 kb的DNA 1次转化只能得到800个左右的克隆，这说明片段越大连接转化的效率越低。本文库的构建采用100 ~ 200 kb的片段做连接，共做13次转化，挑取57 600个克隆，冻存在384孔板中。
2.5 BAC文库质量的检测
2.5.1 插入片段及空载率的检测
随机挑取200个克隆，用碱裂解法提取质粒DNA ，Not Ⅰ酶切后检测插入片段的大小及空载率（图
3），并统计各长度片段的分布情况（图4）。经统计，200个克隆中插入片段多集中在90 ~ 120 kb之间，85%的BAC 插入片段在90 kb以上，片段大小的均一性较好，平均插入片段大小为98.4 kb。200个克
1期 冯大领等：大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定 155
隆中有3个无插入片段，空载率为1.5%。如果以大白菜单倍体基因组总长度550 Mb（Johnston et al.，2005）计算，本文库重组子的覆盖率达到大白菜基因组的10.3倍。
图 3 BAC克隆插入片段大小检测
Fig. 3 Evaluation of insert size of BAC clones
图 4 BAC文库中插入片段的分布
Fig. 4 Distribution of BAC clones insert sizes
2.5.2 BAC克隆的稳定性检测
随机挑取6个BAC 克隆进行培养，然后将培养1 d（约25代）、3 d（约75代）、5 d（约125
代）的菌液分别提取质粒进行Hin d Ⅲ完全酶切和电泳检测。结果表明，各个克隆经过约125代左右 的繁殖，DNA 指纹图谱没有变化（图5），这证明DNA 插入片段能够在大肠杆菌中稳定遗传，克隆的稳定性较好。
图 5 BAC克隆的稳定性检测
Fig. 5 Stability analysis of BAC clones
156 园 艺 学 报 38卷 3 讨论
BAC 文库构建中，DNA 提取的质量好坏是连接转化的关键之一（Kim et al.，1996）。提取DNA 的质量主要是指包埋胶块中DNA 的纯度、浓度及片段大小。胶块中DNA 的纯度与DNA 提取过程中材料的选取关系很大，一般采用幼嫩的真叶，也有用子叶成功的报道（王省芬 等，2006）。本试验曾采用幼嫩的子叶为材料提取DNA ，胶块的颜色较白，经酶切的DNA 用于连接转化时，转化率很低，只有几个克隆。可能是由于幼苗培养时间短，子叶中含有较多的淀粉和蛋白质等营养物质，造成DNA 纯度不高，影响了酶切效果，最终造成连接转化失败。幼嫩的真叶细胞含有的营养物质较少，对获得纯度高的DNA 有利。提取的DNA 片段大小达到700 kb以上时，才能经部分酶切、电泳、洗脱等系列过程后获得足够大小的目的DNA 片段，若在提取过程中降解太多，使得胶块中的DNA 片段太小，浓度也降低，就不能满足后续试验过程的需要。洗脱后用于连接的DNA 浓度太
，往往造成连接的失败。 低（＜2 ng · μL -1）
DNA 部分酶切主要受酶浓度和酶切时间的影响，因此，控制部分酶切主要有两种方式，一是酶浓度固定，酶切时间不同，二是酶切时间固定，调节酶浓度，多数研究采用第2种酶切方式。王省芬等（2006）研究棉花BAC 文库构建时，在200 μL 反应体系中酶切半个胶块，酶切时间固定在30 min ，酶用量在3 ~ 4 U之间酶切效果最好，而本研究在同样的酶切体系中用同样的酶切时间，酶用量在1.5 ~ 2.5 U之间酶切效果最好。因此，不同植物材料酶切时间相同时，酶浓度却有所不同。
部分酶切后的DNA 常采用2次电泳选择法获得目的大片段。研究证实，DNA 电泳后，割取的DNA 经回收用于连接转化后，往往获得很多小于目的DNA 的插入片段。Huo 等（2006）割取150 ~ 350 kb的DNA 获得的插入片段在30 ~ 200 kb之间，陈书元等（2008）割取100 ~ 350 kb的DNA 获得的插入片段在50 ~ 300 kb之间。可见，割取的100 ~ 200 kb的DNA 中往往混杂有100 kb以下的片段，200 ~ 300 kb的DNA 中含有200 kb以下的片段。酶切后的DNA 经过多次电泳选择去除小片段的效果比1次选择好，电泳次数越多，割取的DNA 片段长度一致性越好，但选择次数越多丢失的DNA 也越多，因此，多选用2次电泳选择法获得大片段DNA 。
BAC 文库构建除了要求获得高质量的DNA 外，还需要高的连接转化效率，连接效率与插入片段的大小密切相关，插入片段越大，连接效率越低。本试验将割取的200 ~ 300 kb的DNA 与载体连接转化，插入片段大小平均为120 kb左右，尽管插入片段比100 ~ 200 kb DNA增大，但1次转化获得的阳性克隆（约800个）只有100 ~ 200 kb片段获得克隆数的16%左右，要得到足够多的克隆，需做的转化次数增加，成本也就大大提高。而在BAC 文库的应用中，90 kb以上的插入片段即可满足试验的要求，因此，本试验采用100 ~ 200 kb的片段进行连接转化构建了大白菜BAC 文库。
References
Bancroft I. 2006. The multinational Brassica genome project. Acta Horticulturae ，706：65–66.
Chen F G，Zhang X Y，Xia G M，Jia J Z. 2002. Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library for Triticum boeoticum.
Acta Botanica Sinica，44：451–456.
Chen Shu-yuan，Chao Jin-quan，Xu You-ming，Wang Tai-xia，Yan Xiao-hong，Wang Li-jun，Hu Qiong，Wei Wen-hui. 2008. Construction of
the BAC library of Brassica napus–Chinese Xinjiang wild rape（Sinapis arvensis）disomic alien addition line. Chinese Journal of Oil Crop Sciences ，30 (2)：137–142. (in Chinese)
陈书元，晁金泉，徐有明，王太霞，闫晓红，王力军，胡 琼，魏文辉. 2008. 甘蓝型油菜—新疆野生油菜二体异附加系BAC 文库的构建. 中国油料作物学报，30 (2)：137–142.
Choi S，Creelman R A，Mullet J E，Wing R A. 1995. Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Arabidopsis
1期 冯大领等：大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定 157 thaliana . Plant Molecular Biology Reporter，13：124–128.
Gao M，Li G，Yang B，McCombie W R，Quiros C F. 2004. Comparative analysis of a Brassica BAC clone containing several major aliphatic
glucosinolate genes with its corresponding Arabidopsis sequence. Genome，47：666–679.
Gu Ai-xia，Zheng Bao-zhi，Wang Yan-hua，Xuan Shu-xin，Luo Shuang-xia，Shen Shu-xing. 2009. Obtaining and studies of Chinese cabbage
monosomic alien addition line with chromosome 3 of cabbage. Acta Horticulturae Sinica，36 (1)：39–44. (in Chinese)
顾爱侠，郑宝智，王彦华，轩淑欣，罗双霞，申书兴. 2009. 附加甘蓝3号染色体的大白菜单体异附加系的获得. 园艺学报，36 (1)：39–44.
Hong C P，Plaha P，Koo D H，Yang T J，Choi S R，Lee Y K，Uhm T，Bang J W，Edwards D，Bancroft I，Park B S，Lee J，Lim Y P. 2006.
A survey of the Brassica rapa genome through BAC-end sequence analysis，and comparative analysis with Arabidopsis thaliana. Molecules and Cells ，22：300–307.
Lazo G R，Vogel J P，Coleman Derr D，Luo M C，Thilmony R，Garvin D F，Anderson O D. 2006. Construction and characterization Huo N，Gu Y Q，
of two BAC libraries from Brachypodium distachyon，a new model for grass genomics. Genome，49 (9)：1099–1108.
Johnston J S，Pepper A E，Hall A E，Chen Z J，Hodnett G，Drabek J，Lopez R，Price H J. 2005. Evolution of genome size in Brassicaceae. Annals
of Botany，95 (1)：229–235.
Kim U J，Birren B W，Slepak T，Mancino V，Boysen C，Kang H L，Simon M I，Shizuya H. 1996. Construction and characterization of a human
bacterial artificial chromosome library. Genomics，34：213–218.
Liu Hua-qing，Zhou Li-jun，Duan Yuan-lin，Huang Dai-qing，Wu Wei-ren，Xue Yong-biao. 2003. Construction of a genomic DNA library of an
indica rice variety H359 based on transformation-competent artificial chromosomes. Molecular Plant Breeding，1 (1)：27–32. ( in Chinese) 刘华清，周丽君，段远霖，黄代青，吴为人，薛勇彪. 2003. 籼稻品种H359基因组可转化人工染色体（TAC ）文库的构建. 分子植物育种，1 (1)：27–32.
Ma Z Y，Song W，Peter J S，Liu C J. 2000. Non-gridded library：A new approach for BAC（bacterial artificial chromosome）exploitation in hexaploid
wheat （Triticum aestivum）. Nucleic Acids Research，28 (24)：e106.
Mun J H，Kwon S J，Yang T J，Kim H S，Choi B S，Baek S，Kim J S，Jin M，Kim J A，Lim M H，Lee S I，Kim H I，Kim H，Lim Y P，
Park B S. 2008. The first generation of a BAC-based physical map of Brassica rapa. Genomics，9：280.
Park J Y，Koo D H，Hong C P，Lee S J，Jeon J W，Lee S H，Yun P Y，Park B S，Kim H R，Bang J W，Plaha P，Bancroft I，Lim Y P. 2005.
Physical mapping and microsynteny of Brassica rapa ssp. pekinensis genome corresponding to a 222 kb gene-rich region of Arabidopsis chromosome 4 and partially duplicated on chromosome 5. Molecular Genetics and Genomics，274 (6)：579–588.
Peng Kai-man，Zhang Hong-bin，Zhang Qi-fa. 1998. A BAC library constructed to the rice cultivar“MingHui 63”for cloning genes of agronomic
importance. Acta Botanica Sinica，40 (12)：1108–1114. ( in Chinese)
彭开蔓，张洪斌，张启发. 1998. 优良水稻品种明恢63BAC 文库的构建. 植物学报，40 (12)：1108–1114.
Qiu F，Jin D M，Fu J M，Zhang C L，Xie W W，Yang R C，Zhang H B，Wang B. 1999. Construction and characterization of a bacterial artificial
chromosome library of thermo-sensitive genie male-sterile rice 5460S. Science in China：Series C：Life Sciences，29 (5)：515–524.
Shen Shu-xing，Hou Xi-lin，Zhang Cheng-he. 2006. A study on obtaining primary trisomics by the isolated microspore culture of autotetraploid
Chinese cabbage. Acta Horticulturae Sinica，33 (6)：1209–1214. (in Chinese)
申书兴，侯喜林，张成合. 2006. 利用小孢子培养创建大白菜初级三体的研究. 园艺学报，33 (6)：1209–1214.
Suwabe K，Morgan C，Bancroft I. 2008. Integration of Brassica a genome genetic linkage map between Brassica napus and B. rapa. Genome，51：
169–176.
Trick M，Bancroft I，Lim Y P. 2007. The Brassica rapa genome sequencing initiative. Genes，Genomes and Genomics，1：35–39.
Vanhouten W，MacKenzie S. 1999. Construction and characterization of a common bean bacterial artificial chromosome library. Plant Molecular
Biology ，40：977–983.
Vicente J G，King G J. 2001. Characterization of disease resistance gene-like sequences in Brassica oleracea L. Theoretical and Applied Genetics，
158 园 艺 学 报 38卷 102：555–563.
Wang Xing-fen，Ma Jun，Ma Zhi-ying，Zhang Gui-yin，Zheng Yong-min. 2006. BAC library construction and characterization of suyuan 7235，a
cotton germplasm with high fiber strength. Cotton Science，18 (4)：200–203. (in Chinese)
王省芬，马 骏，马峙英，张桂寅，郑拥民. 2006. 高纤维强力棉花种质系苏远7235BAC 文库的构建. 棉花学报，18 (4)：200–203. Yang J L，Wang Q H，Deng D Y，Weng M L，Yin X Y，Jin D M，Zhang J R，Wang B. 2003. Construction and characterization of a bacterial artificial
chromosome library of maize inbred line 77Ht2. Plant Molecular Biology Reporter，21 (2)：159–169.
Zhang F D，Zheng Y L，Cao Z G. 2000. Construction of a bacterial artificial chromosome library of S-type CMS maize mitochondria. Chinese
Science Bulletin，45 (18)：1692–1697.
Zhang H B，Zhao X，Ding X，Paterson A H，Wing R A. 1996. Preparation of megabase-sized DNA from plant nuclei. Plant Journal，7：175–184. Zhang Wei-wei，Shen Shu-xing，Wang Yan-hua，Chen Xue-ping，Xuan Shu-xin，Luo Shuang-xia，Li Xiao-feng. 2009. Studies on isolated microspore
culture of the allotriploid hybrids between cabbage and Chinese cabbage. Acta Horticulturae Sinica，36 (4)：583–586. (in Chinese)
张巍巍，申书兴，王彦华，陈雪萍，轩淑欣，罗双霞，李晓峰. 2009. 结球甘蓝—大白菜异源三倍体小孢子培养的研究. 园艺学报，36 (4)：583–586.
Zhang Yu-cheng. 2008. Creation of several cabbage–Chinese cabbage monosomic alien addition lines[M. D. Dissertation]. Baoding：Agricultural
University of Hebei. (in Chinese)
张玉成. 2008. 结球甘蓝—大白菜部分单体异附加系的创建[硕士论文]. 保定：河北农业大学.
图书推荐
《新编拉汉英植物名称》 王宗训主编
本书收集具有经济价值和学术价值或通俗常见的种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类植物、真菌、地衣名称55 800条。每种植物名称有拉、汉、英三种文字对照，按拉丁文字母顺序排列。书后附有英文俗名和汉名索引。
本书可供农、林、医药、环境保护等学科的管理机构、科研单位、大学中的科技人员以及生物工程、植物检疫、花卉园艺、新闻出版、旅游、外贸等专业的技术人员使用，也是各类图书馆典藏的重要工具书。定价：185元（含邮费）。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街12号中国农科院蔬菜花卉所《园艺学报》编辑部，邮编100081。