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722 ・中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年3月第30卷第3期 CJTCMP,March 2015,Vol.30,No.3
・论著・
生物样品测定分析方法中提取回收率的探讨
杨培1，林龙飞1，田宇2，张慧1，王卫华2，倪健1
（1北京中医药大学中药学院，北京 100102；2清华大学生物医学测试中心，北京 100084）
摘要：目的：验证提取回收率的范围限定是否应当列入生物样品测定方法学规范中。方法：以芍药苷为代表药物，大鼠血浆为基质，分别采用蛋白沉淀法（PP）和固相萃取法（SPE）进行生物样品的前处理，对所得的精密度、准确度和提取回收率3个主要指标进行数据分析，并进行口服给药后大鼠体内芍药苷药时曲线的测定。结果：不同前处理方法所得的样品，在精密度、准确度两项指标上并无数理统计差异，提取回收率存在显著差异，但对大鼠口服芍药苷的药动学指标检测并无影响，两种方法均测得芍药苷均在30min有最大吸收，Cmax-PP=（597.49±58.90）ng/mL，Cmax-SPE=（615.50±22.52）ng/mL。结论：在药物研发中，根据被测药物的浓度、基质效应的影响，合理选择前处理方法，而不将提取回收率限定范围作为方法学确证的判断指标是值得提倡的环保经济的研究原则。
关键词： 药代动力学；回收率；蛋白沉淀法；固相萃取法；液质联用技术基金资助：国家科技重大专项课题（No.2012ZX09103201-026）
Discussion of recovery in biological sample determination methodology
YANG Pei1, LIN Long-fei1, TIAN Yu2, ZHANG Hui1, WANG Wei-hua2, NI Jian1
( 1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2Center of Biomedical
Analysis, Tsinghua University, Beijing 100084, China )
Abstract: Objective: To verify whether it is necessary to define a specific range of recovery in biological sample
determination methodology. Methods: Paeonifl orin was adopted as a pharmic sample along with the employment of rats’ plasma as matrix in this study. The selection of precipitation protein (PP) and solid-phase extraction (SPE) as designate method to process the determination of paeonifl orin. After that, the data generated by precision, accuracy and rate of recovery were processed by data analysis. Results: The results indicate that there was no diff erence on the index of precision and accuracy according to mathematical statistics. Therefore, there was no impact to study in vivo pharmacokinetics although a signifi cant diff erence was shown on the rate of recovery. The maximum effi cacy of two methods was 30in and Cmax-PP=(597.49±58.90)ng/mL, Cmax-SPE=(615.50±22.52) ng/mL. Conclusion: It is encouraged to conduct the future development of drugs by choosing feasible pretreatment methods and adopting the data from concentration of testing drugs and eff ect of matrix instead of relying on the range of recovery as an indicator of methodology determination.
Key words: Pharmacokinetic; Recovery; Protein precipitation; Solid-phase extraction; LC-MS/MS
Fund assistance: National Science and Technology Major Project (No.2012ZX09103201-026)
生物分析方法学验证是生物分析测定的关键，是药代动力学研究的基础。生物分析方法验证的基本参数包括准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性和稳定性。此外，标准曲线、提取回收率和定量范围也是应当考察的内容。中国国家食品药品监督管理总局于2013年4月在其官方网站上发布了《药物非临床药代动力学研究指导原则（第二稿）》，其中对精密度、准确度进行了明确的限定：精密度用质控样品的批内和批间相对标准偏差（RSD）表示，相对标准偏差一般应小于15%，在定量下限附近应小于
20%；准确度一般应在85%-115%范围内，在定量下
限附近应在80%-120%范围内。对提取回收率的描述则为“应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密和可重现”。
然而，在已发表的一些研究结果中，有研究人员将提取回收率的有效范围标定在85%-115%或80%-120%。而为了达到此限定范围的回收率，则通过使用固相萃取小柱的方法进行生物样品的前处理，希望
同时，其他尽可能地减少基质对被测组分的干扰[1-2]。
研究表明当回收率低于80%时，如果基本参数满足规
通讯作者：倪健，北京中医药大学中药学院，邮编：100102，电话：010-84738607，E-mail：njtcm@263.net
中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年3月第30卷第3期 CJTCMP,March 2015,Vol.30,No.3
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定时，所建立的方法也能成功地用于生物样品的测定分析。科研人员对糖敏灵片（TMLP）高、中、低3个浓度样品进行了提取回收率的测定，所测得的回收率范围在53.7%-74.8%之间，相对标准偏差RSD值小于11%，两种内标化合物的平均回收率为（63.2±5.0）%和（67.1±3.8）%。此法成功测定分析了口服TMLP后
另一项研究结果表大鼠血浆中的药代动力学参数[3]。
明，槲皮苷在不同浓度级别中的回收率差异显著，范围在65%-90%不等，但也被成功地用于测量其在大
基于以上不同的研究鼠血浆中的药代动力学参数[4]。
结果，查询由美国食品药品监督管理局药品评价研究中心发布的生物分析方法学验证指导原则。其中关于回收率的规定如下：被分析物的回收率不需要达到100%，但被分析物和内标化合物的回收率应精密和可重现。回收率实验必须在高、中、低3个浓度下进行。为了验证提取回收率是否需要进行限定的问题，本研究选取芍药苷为代表药物，以大鼠血浆为基质，分别采用蛋白沉淀法（PP）和固相萃取法（SPE）进行生物样品的前处理，然后采用液质联用色谱法进行样品测定，对所得的精密度、准确度和提取回收率3个主要指标进行数据分析，并进行口服给药后大鼠体内芍药苷药时曲线的测定。
材料安捷伦6460三重四级杆串联质谱仪，配高效液相色谱仪1290（Agilent Technologies, Germany）。芍药苷和栀子苷均购自中国食品药品检定研究院（纯度>98%），甲醇、乙腈和甲酸（色谱级，Fisher Scientific，NJ，USA），超纯水（18.2 mΩ.cm）（Pall Corporation，USA）。SD大鼠雄性大鼠[清洁级，体质量（250g±10）g]，许可证号：SCXK（京）2012-0001，购自维通利华实验动物有限技术公司。
方法1. 液相色谱-质谱条件 液相色谱条件：Agilent
3.5μm）；流动相A：甲C18色谱柱（50mm×2.1mm，
醇，流动相B：0.1%甲酸水溶液；梯度程序：0-3min，30%A，3-6min，30%-100%A，6-8min, 100%A，8-8.1min，100%-30%A，8.1-11min，30%A；流速：0.2mL/min；进样量：10μL。
质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI-）；扫描方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：3 500V；加热器气体温度：350℃。
2. 血浆样品的处理方法2.1 蛋白沉淀法 甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲醇-乙腈（1 2）4个不同的溶剂被用于蛋白沉淀，同时考察每种溶剂在加入1%磷酸溶液和不加磷
酸溶液两种情况下的检测结果。得到S1-S8 8个样本，其中芍药苷和栀子苷的终浓度分别为100ng/mL和200ng/mL。
以甲醇为例，其样品制备过程如下：80μL血浆样品与10μL芍药苷、10μL栀子苷涡旋混合30s，再加入400μL甲醇，涡旋混合30s。混合溶液在14 800 r/min下离心10min。取250μL上清液转移到新的离心管，真空旋转离心干燥。完全干燥后的离心管残渣用100μL30%甲醇复溶，离心后上清液即样品S1。将400μL甲醇减少至350μL，再加入50μL 1%磷酸溶液，同法制备得样品S2。
将甲醇更换成乙腈、甲醇-乙腈（1 2）溶液，分别制备得到样品S3-S6。将甲醇更换为乙酸乙酯时，乙酸乙酯的用量为1 000μL，取上清液量增至550μL，其余不变，得样品S7-S8。
Grace 2.2 固相萃取法 C18固相萃取柱（1mL，
Davision Discovery Sciences，USA）先用2mL甲醇活化，再采用2mL水洗脱备用。180μL血浆样品与10μL芍药苷、10μL栀子苷涡旋混合30s，取100μL混合好的含药血浆加至活化好的固相萃取柱，依次采用2mL水、1.5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，真空旋转离心干燥。完全干燥后的离心管残渣用100μL 30%甲醇复溶，离心后上清液即样品S9。170μL血浆样品与10μL芍药苷、10μL栀子苷、10μL 1%磷酸溶液混合，同法制备得样品S10。
3. 给药剂量 采用灌胃给药的方式给予大鼠芍药苷水溶液，剂量为52.08mg/kg。眼眶取血，给药后的采血时间点分别为5、10、15、20、30、60、120、360、720min。10 000r/min离心10min所得血浆样品于-20℃冷冻保存。所有的药代动力学参数采用
Kinetica 4.4软件进行数据处理及分析。
图1 PP和SPE样品色谱图
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x±s，n=6）表3 两种前处理方法的药动学参数（-方法PPSPE
Cmax（ng/mL）597.49±58.90615.50±22.52
Tmax（min）30±030±0
AUC0-t（ng・min-1・mL-1）69 351.47±17 727.1272 589.62±10 011.95
MRT（min）231.52±34.92216.63±44.84
结果
如图1所示，S1、S3、S5、S7为不加磷酸溶液沉淀
所得样品，S2、S4、S6、S8分别是加入1%磷酸溶液后进行蛋白沉淀所得样品。从响应值可以看出，是否加入磷酸进行沉淀对芍药苷的测定无显著影响。但与S9、S10样品相比，SPE所得的样品显现出更好的测定结果：PP所得的样品峰面积均在900以下，而SPE法所得的样品峰面积已经超过2 200。在此基础上，本课题组选择PP和SPE两种方法作为代表，对精密度、准确度和提取回收率3个主要指标进行比较，并进行口服给药后大鼠体内芍药苷药时曲线的测定。
1. 方法学考察
1.1 选择性 芍药苷和栀子苷色谱峰的保留时间分别为1.94、2.34min，空白血浆相同位置无色谱峰，说明本法选择性良好。
空白血浆色谱图见图2。
分别用PP和SPE进行预处理后测定其色谱峰面
积。以芍药苷色谱峰面积为纵坐标、血浆芍药苷浓度为横坐标进行线性回归，得标准曲线方
yPP=0.468464x-7.011101×10-4（R=0.9997），程：
-4
ySPE=0.334518x-6.622229×10（R=0.9998），结果均满足动物实验定量分析的要求。
1.4 提取回收率 测定10、500、1 000ng/mL3个浓度下两种样品处理方法的提取回收率，结果见表2。两种方法的提取回收率有显著差异，采用PP处理所得的回收率远远低于SPE，PP的芍药苷提取回收率范围为72.17%-83.73%，而SPE为87.88%-90.08%。
-±s，n=6）表2 两种前处理方法的回收率实验结果（x
方法PP
浓度（ng/mL）
105001 000
SPE
105001 000
回收率（%）72.17±3.80*83.05±2.77*83.73±4.60*87.88±2.5993.60±4.9190.08±3.40
图2 空白血浆色谱图
注：回收率（%）=介质提取前加入标准品的检测响应值的均值×
*
P
1.2 精密度和准确度 在10、500、1 000ng/mL 3个
浓度下，分别测定PP和SPE处理所得样品的日间精密度、日内精密度和准确度，结果见表1。实验结果表明，两种方法均符合要求，精密度RSD
表1 两种前处理方法所得样品的精密度和准确度方法
精密度（RSD，%）
浓度
准确度（%）
（ng/mL）日间（n=6）日内（n=3）
105001 000
SPE
105001 000
10.607.735.699.777.715.48
8.407.385.618.626.055.40
97.1096.6398.6097.4497.4498.87
2. 药动学研究 测定口服芍药苷后大鼠血浆
药物浓度，拟合药代动力学模型，计算药代动力学参数，比较不同前处理方法所测得的参数是否存在差异。实验结果表明，两种方法均测得芍药苷均在30min有最大吸收，Cmax-PP=（597.49±58.90）ng/mL，
结果见表3，二者药Cmax-SPE=（615.50±22.52）ng/mL，
代动力学参数无显著差异。两种方法测定所得的药
时曲线图如图3所示。
PP
1.3 标准曲线 采用空白大鼠血浆配制血浆芍药苷标准溶液，浓度范围为10-2 000ng/mL。
时间（min）
图3 两种前处理方法所得药时曲线图
中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年3月第30卷第3期 CJTCMP,March 2015,Vol.30,No.3
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725 ・
讨论
选择不同的生物样品的前处理方法可以一定程度地减少基质效应对样品测定的影响、提高生物样品
一项研究声称，当使用以甲醇为洗的提取回收率[5-6]。
脱溶剂、采用SPE对生物样品进行处理后，能够避免磷脂对样品的干扰，检测方法的选择性和灵敏度都显
本研究基于已查证的生物样品分析方法著优于PP[7]。
学验证指导原则，假设将提取回收率限定在一个有效范围内并不是必须的，在确保其他参数达到规定的基础上，提取回收率只需精密可重复就能有效地进行生物样品的分析。芍药苷和栀子苷分别被选为被测化合物和内标化合物进行了以上的实验。
芍药苷是毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora
作为主要Pall.）干燥根中的一个特征性的单萜苷[8]，
的活性成分，现代研究指出其与“血虚证”等中医证
芍候密切相关，它常用作芍药质量评价的指标[8-9]。最药苷具有镇痛、降血糖、抗血栓等药理作用[10-12]，
HPLC-UV、新研究表明芍药苷还具有抗癌作用[13]。
HPLC-ESI-MS被广泛用于检测血浆样品中的化合物，PP[14-17]和SPE[18-22]作为主要的样品预处理方法也被大家所熟知。从2003年开始，就有研究人员将SPE
然而，至应用于检测生物样品中芍药苷的前处理[23]。
今仍有研究人员在使用PP进行相关研究。目前暂无相关研究或报道对不同样品预处理方法的检测芍药苷所得的结果进行比较，也没有研究表明SPE对于血浆样品的前处理是必须的。
实验研究结果表明，两种样品前处理方法均符合生物样品测定分析方法的要求，并被成功地用于大鼠口服芍药苷的体内研究，即便其提取回收率小于80%。但应用的前提首先是测定的浓度范围、精密度和准确度等其他参数都符合相关要求。正如已查阅的指导原则所提及的一样，需要的是确保提取回收率的精密和可重现，而不应误解为一个标准的提取回收率范围，因此而增加了样品前处理工作量，提高了实验成本。通过此研究结果，希望对后期进行相同工作的科研人员起到一定的启示：根据被测药物的浓度、基质效应的影响，合理选择前处理方法，是值得提倡的环保经济的研究原则。
参 考 文 献
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・论著・
冠心病证候与客观指标的Logistic回归分析
曲淼1，张明雪2
（1辽宁中医药大学，沈阳 110847；2辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032）
摘要：目的：探讨冠心病证候与实验室客观指标的相关性。方法：通过临床专家问卷调查收集到1 218份合格的冠心病证候数据资料，运用SPSS 16.0软件进行二值Logistic回归分析。结果：心电图对瘀血阳微证、心肺气虚证和气阴两虚证有诊断意义；心脏X线对气阴两虚证、心肺气虚证、气滞痰阻证和阳虚气滞证有诊断意义；心脏彩超对寒凝心脉证、气滞心胸证、气阴两虚证、瘀血阳微证和心气虚证有诊断意义；心肌酶学指标对气滞痰阻证的诊断有鉴别作用；心肌钙蛋白对气滞痰阻证、心肺气虚证和气阴两虚证的诊断有鉴别作用；冠脉造影对气阴两虚证、气滞痰阻证、寒凝心脉证有诊断意义，血脂对瘀血阳微证、肝脾不调证、气滞痰阻证和气阴两虚证有诊断意义；血液流变学指标对气滞心胸证和气滞痰阻证的诊断有鉴别作用。结论：实验室客观指标对冠心病证候有诊断意义，为进一步开展诊断性试验提供依据。
关键词：Logistic回归分析；证候；客观指标
基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81273698），辽宁省中医药临床学（专）科能力建设项目（No.2012-lnzyxzk-01），沈阳市科技计划项目（No.F12-155-9-00），辽宁省特聘教授和辽宁中医药大学青蓝学者工程基金资助
Logistic regression analysis in syndromes of coronary heart disease and objective indexes
QU Miao1, ZHANG Ming-xue2
( 1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China; 2The First Affi liated Hospital of Liaoning
University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China )
通讯作者：张明雪，辽宁中医药大学附属医院心病2科，邮编：110032，电话（传真）：024-86902791， E-mail：zhmx6228@163.com