摘 要
目的 药物敏感性试验简称药敏试验，旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感程度，指导临床合理选用抗生素的种类和用量，以做到利用药物对疾病进行更加准确的治疗。由于在实践操作中所进行的各种标准药敏试验的周期较长，一般需要耗用几十个小时，且操作过程较复杂，需要有经验的专业实验人员进行反复验证。因此，建立灵敏、快速和操作简单的药物敏感性试验方法在科研应用方面具有非常重要的意义。本研究以普鲁士蓝(PB)为光学探针，大肠埃希氏菌(E. coli)为模型微生物所构建一种新型的光学体外药敏试验方法，用于快速的检测出药物有效性及筛选出抗菌新化合物，弥补现有的方法缺陷。方法实验以K3[Fe(CN)6]为电子受体，定量转移微生物呼吸作用所产生的电子，自身被还原为K4[Fe(CN)6]，与后续加入的FeCl3反应生成普鲁士蓝(PB)。当微生物的活性受到抑制时，其呼吸作用会减弱，相应生成的PB的量也会减少。因此，可通过700nm处测定PB的吸光度确定受试微生物活性变化。通过考察[Fe(CN)6]4-的生成量，确定体系的稀释倍数和FeCl3的加入量；通过考察吸光度值与E. coli固定时间的关系，确定氧化石墨烯(GO)固定E. coli的最佳时间；通过比较固定化E. coli在Luria-Bertani(LB)培养基和磷酸缓冲溶液中活性随存储时间的变化趋势，确定最佳存储条件；根据吸光度值的变化，将最优条件下制备的GO固定E. coli颗粒用于检测阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、万古霉素、头孢噻肟钠5种抗生素的有效性。结果4h培养时间内，45 mmol/LK3[Fe(CN)6]足够用于转移微生物呼吸作用产生的电子，但生成的K4[Fe(CN)6]量过多，导致生成的PB沉淀，因此应在加入FeCl3之前，将培养液稀释至5 mmol/L。当固定时间为16 h时，以具有表面GO结构的石墨颗粒为载体的E. coli固定效果最好。培养相同的时间，在PBS中保存的GO固定E. coli的吸光度值比其在培养基中保存时的吸光度值小。以GO固定E. coli为受体的光学方法进行药物的有效性检测中，抗生素对菌体活性的影响与接触时间和抗生素种类相关。阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和头孢噻肟钠均可对E. coli产生明显抑制作用；相比之下，万古霉素的作用较弱。结论 与一般的药物有效性检测方法不同，在优化条件下的基于GO固定E. coli的PB光学检测方法更加简便、快捷、低耗、价廉，同时具有较好的灵敏度。所以，该方法在抗菌类药物的检测和临床诊断方面具有一定的应用潜力。
关键词：药敏实验；普鲁士蓝；光学方法；抗生素；药物有效性
ABSTRACT
Objective The drug susceptibility test referred to as the drug sensitivity test
, which is designed to understand the sensitivity of pathogenic microorganism to various antibiotics in order to guide clinical rational selection of the types and dosage of antibiotics. So the drug susceptibility test ensures a more accurate use of drug to treat the objective disease. However, the testing cycle of various standard drug susceptibility tests are so long, even spending dozens of hours. Otherwise, the standard drug susceptibility test is often needing complex operations and professionals to repeatedly verify the accuracy of the test results. Therefore, establishment of a rapid, sensitive and simple drug susceptibility test is of great significant in scientific research and application. .This study applies a common dye - Prussian blue (PB) as a optical probe and Escherichia coli (E. coli) as a model microorganism to build a novel optical drug susceptibility test in vitro for rapid detection of drug effectiveness and screening of new antibacterial compounds. We expect that this novel method is making up the defects of existing drug susceptibility test. Methods In our test, K3[Fe(CN)6] that was as a electron carrier was used to transfer the electrons from bacterial respiration. Then reduction product of K4[Fe(CN)6] was mixed with an addition of FeCl3 to generate prussian blue (PB). The bacterial respiration should be weakened when the bacterial activities were inhibited. So the production of PB was reduced. Therefore, the bacterial activities could be measured at PB absorbance of 700 nm. Production of [Fe(CN)6]4- was studied to ensure a suitable dilution ration of our system and additional concentration of FeCl3. The relationship between absorbance value and immobilized time was studied to screen an optimum immobilized time of E. coli on GO. Two different stored methods, such as Luria-Bertani (LB) culture and phosphoric acid buffer solution, were respectively studied to screen an optimum stored condition. Finally, our optimum conditions were used to prepare GO immobilized E. coli for detecting the effectivenesses of antibiotics, such as amikacin, gentamicin, levofloxacin, vancomycin and cefotaxime sodium. Results K3[Fe(CN)6] of 45 mmol/L was enough to transfer all electrons from bacterial respiration within 4 h incubation time. But the production of K4[Fe(CN)6] was too many to produce stable PB solution. So the incubation culture should be diluted and ensured the content of K4[Fe(CN)6] of 5 mmol/L before addition of FeCl3 solution. The optimum immobilized time of E. coli was 16 h when the graphite particles was modified with GO structure on its surface. At the same incubation time, the PB absorbance produced by respiration of E. coli that was stored in the PBS was lower than E. coli that was stored in the LB culture. The GO immobilized E. coli was as testing model to apply into test of drug effectiveness with optical method. All results showed that the effectivenesses of antibiotics on the bacterial activities were related to the conta
ct time and the kinds of used antibiotics. The antibiotics of amikacin, gentamicin, levofloxacin and cefotaxime sodium all showed obviously inhibitions on the respiration of E. coli. Comparing with other four kinds of antibiotics mentioned above, the effectiveness of vancomycin was weaker. Conclusion It was different from general drug effectiveness detection method, the PB optical detection method with GO immobilized E. coli was simpler, lower consumption, rapider and cheaper, well with good sensitivity. So our study has a cetrain potential in the detection and clinical diagnosis of antibacterial drugs.
Keywords: Drug susceptibility test; Prussian blue; Optical methods; Antibiotics; Drug effectiveness
前 言
随着抗菌药物在我们日常生活中的广泛使用，导致越来越多的细菌开始对药物产生耐药性，给由细菌导致的疾病的治疗带来了非常大的困难。目前致病性耐药菌已成为大家广泛关注的一个问题，要解决这一严峻的问题不仅需要我们有不乱使用抗生素的意识，同时也需要研发出新的更有效的抗生素开对抗细菌以及耐药菌。但是现在生产抗生素的技术发展非常的缓慢，相关的研究也不是很规范，达不到现在医药生产企业对药品生产效率的要求，影响了企业对新药的研发进程。
研发新药时需要建立药物量-效曲线关系模型以及确定所治疗疾病。研发抗菌药物，确定目标疾病与筛选微生物和剂量确定是分不开的。测药物对微生物抑制作用的大小所用的方法为药物的敏感性实验，他是估计药物对细菌抑制作用的比较方便的方法，且由于其具有较好的准确度和重复性，所以被用于初期筛选新药以及监测抗菌药物疗效和检测细菌耐药性。在对药物进行敏感实验时宜用阴性对照的方法，但是近年来在药物的提取，合成以及后来的药物敏感性检测中有较大量的使用，所以一般的阴性对照试验对药敏实验的安全和准确已不能保障。
新药的研发除了需要时间，大量的人力物力，还要克服成功率低，具有相对较高的风险，周期和投入等实际问题。现在纸片扩散法仍然是作为抗菌药物进行有效性检测的体外测试方法，但纸片扩散法的实验周期相对较长，需要消耗大量的试剂且需要专业的工作人员操作，给药物的研发增加了很多的任务。因此我们需要寻找能克服上述缺点的一种方法来完成对临床进行药效监测和研发新的抗菌药。例如，PCR技术。这些新的药敏实验方法能够更快速，更灵敏的获取耐药性微生物的信息。虽然新型的药物检测方法相对于传统方法在灵敏度、准确度方面有优势，但是新型的药敏实验方法需要更高的实验费用。
本实验采用光学方法，以铁氰化钾做为反应体系，通过微生物的呼
吸作用使之发生电子转移生成亚铁氰化钾，然后根据其与三氯化铁生成普鲁士蓝进行光学检测。通过探究微生物使用的浓度，培养的时间以及所给的营养物质对灵敏度的影响确定适宜的检测条件。并应用哌拉西林、阿莫西林、庆大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星5种常见抗生素对20株E. coli临床分离物的实际检测。然后与传统的药物敏感性实验结果进行比较。
实验部分
1 仪器和试药
1.1 材料和试剂
磷酸氢二钠 天津市瑞金特化学品有限公司，磷酸二氢钾 天津市博迪化工有限公司，硼酸 沈阳市联邦试剂厂，无水碳酸钙天津永晟精细化工有限公司，葡萄糖 北京化工厂，铁氰化钾 天津博迪化工股份有限公司，谷氨酸，盐酸左氧氟杀星氯化钠注射液 黑龙江科伦制药有限公司 批准文号：国药准字 H20055367，硫酸庆大霉素注射液 河南润弘制药股份有限公司 批准文号 H41020318，硫酸阿米卡星注射液 江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂 批准文号H32021408 ，注射用盐酸万古霉素 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 批准文号H20033366，头孢噻肟钠 哈药集团制药总厂 批准文号H23021721，3,5-二氯苯酚(DCP) 沈阳市联邦试剂厂。实验用的E. coli来自于锦州医科大学附属一院，经活化后用15%甘油置冰箱中冷冻保存。
1.2 溶液配制
Luria-Bertani(LB)培养基：胰蛋白胨10.0g L-1，酵母粉5.0g L-1，NaCl 10.0g L-1，用0.1mol L-1 NaOH调节pH至7.4±0.2，120°C灭菌20 min，待用。
PBS：0.12mol L-1 Na2HPO4，0.08mol L-1 KH2PO4。
GGA：葡萄糖150mg L-1，谷氨酸150mg L-1。
K3[Fe(CN)6]储备液：采用去离子水配制330mmol L-1 K3Fe(CN)6，实验当天使用。
1.3 实验仪器
电化学工作站820C 才华仪器有限公司，CJJ79-1磁力加热搅拌器， 电子天平 沈阳龙腾电子有限公司；压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；721紫外分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；洁净工作台SW-CJ-1E(洁净等级100级) 上海博迅实业有限公司。
2 方法和结果
2.1 石墨烯颗粒的制备
GO不仅具有很好的电子传导速度(1000m/s)，其结构和组成的特殊性也使得该材料的光学性能、生物相容性和机械强度等性质较为优越，所以在生物传感领域应用广泛。本文通过制备具有表面GO结构的载体，固定E. coli，用于开发抗生素类药物有效性检测的光学微生物传感技术。
准确称取150g石墨棒将其切成15cm左右长度放置于500mL中，用量筒准确量取200mL浓硫酸，将其缓慢倒入烧杯中浸没石墨棒，充分反应20min。准确称取NaNO2和KMnO4各5g备用。先将NaNO2投入石墨棒-浓硫酸反应体系中，并迅速转移至冰水浴中保存；投入已准备好的KMnO4，用玻璃棒持续搅拌。待石墨棒表面出现大量的孔隙且搅拌费力时，立
即将烧杯放入温水浴中1min，再转移至80℃的水浴锅中，直至烧杯壁上有大量的气泡附着时,加入200mL的去离子水停止反应。加入10%盐酸后，将表面具有大量GO结构的石墨棒趁热过滤，并用去离子水洗涤数次至无SO42-为止。将表面具有大量GO结构的石墨棒封入透析袋，置于装有去离子水的大烧杯中浸没，隔两小时换一次水，并用pH试纸测定其酸碱度。待pH近中性，取出短棒，放入恒温摇床于37℃烘干后，切成3cm左右的颗粒置于烧杯中备用。
2.2 GO固定大肠杆菌颗粒的制备
在无菌条件下将0.2mL E. coli菌种接种到已灭菌的300mL LB培养基中后，向培养基中投入切粒整齐的具有表面GO结构的石墨颗粒，以灭菌锡纸封口，并置于恒温摇床中培养。达到预定培养时间后,以灭菌药匙捞出GO固定E. coli颗粒，备用。
2.3 电化学方法测试[Fe(CN)6]4-的浓度
新鲜配330mmol/LK3[Fe(CN)6]储备液并将其存放在冰箱里保存，取4支1mL心管分别加入0.1mL的45mmol L-1 的K3[Fe(CN)6]溶液，0.1mL的220mg L-1的GGA溶液，然后用新鲜配置的PBS溶液将其稀释至1mL。向4支小离心管中分别投入已经18h培养的GO固定E. coli颗粒后，置于37°C的恒温摇床中培养，分别于1h、2h、3h和4h一管进行测试。根据前人研究表明，E. coli呼吸作用所产生的电子可通过Fe(CN)63-转移至微生物体外，同时[Fe(CN)6]3-转变成 [Fe(CN)6]4-，因此可采用电化学工作站结合计时电流法检测培养液经不同培养时间所含[Fe(CN)6]4-的量。置外加电压为450mV，工作电极为Pt微阵列电极，参比电极为Ag/AgCl(饱和KCl)电极，对电极为铂电极，响应时间为15s
如下图2.3a所示，随着培养时间的增加，极限电流值也在不断增大，说明培养液中所含的[Fe(CN)6]4-的量在不断增加。以5mmol/L K4[Fe(CN)6]的极限电流值为参考，计算不同培养时间时，培养液中所含[Fe(CN)6]4-的浓度(图2.1b)。当培养时间分别为1h、2h、3h和4h时，所测得的电流值分别为3.202e-8A、7.969e-8A、9.832e-8A、12.62e-8A ，5mmol/L K4[Fe(CN)6]的电流值为2.000e-8A，由比例关系可求得相对应时间内因微生物呼吸作用产生[Fe(CN)6]4-的浓度分别为8.004mmol/L、19.92mmol/L、24.58mmol/L、31.55mmol/L。因K4[Fe(CN)6]与FeCl3反应所生成普鲁士蓝的摩尔比为1:1，所以可根据上述计算结果得出需要加入的FeCl3量。但根据实验结果，当加入FeCl3的浓度超过5mmol/L时，普鲁士蓝絮凝，因此应适当稀释含有[Fe(CN)6]4-的培养液后再加入FeCl3，使之生成稳定的普鲁士蓝溶液。
Fig2a The curve of relationship between incubation time and limiting current
图2a 培养时间和计时电流的关系曲线
Fig2b The curve of relationship between incubation time and potassium ferrocyanide concentration.
图2b 培养时间和亚铁氰化钾浓度的关系
曲线
2.4 筛选GO固定E. coli的最佳反应时间
在无菌条件下将0.2mLE. coli菌种接种到已灭菌的300mLLB培养基中后，向培养基中投入切粒整齐的具有表面GO结构的石墨颗粒，以灭菌锡纸封口，并置于恒温摇床中培养6h、8h、10h、12h、16h、18h、20h和24h。达到培养时间后,以灭菌药匙捞出GO固定E. coli颗粒，备用。将已固定细菌的GO颗粒置于由0.1mL、0.15g/LGGA溶液，0.1mL、0.045mol/L K3[Fe(CN)]6溶液以及0.8mLPBS溶液所组成的培养液中反应1h。PBS溶液是由 0.12mol?L-1 Na2HPO4以及0.08mol?L-1 KH2PO4配制而成。根据2.3实验结果，制备普鲁士蓝溶液前应对培养液适当稀释：用枪头精确吸取培养液0.2mL，加入1mL的去离子水稀释，然后加入新鲜配置的0.08mol/L的FeCl3溶液2mL，摇匀，生成普鲁士蓝。利用紫外分光光度计于700nm处测定普鲁士蓝的吸光度，因普鲁士蓝的生成量与微生物的活性成正比关系，因此可根据所测得的吸光度值筛选GO固定E. coli的最佳反应时间。
实验数据如图2.3所示，随着培养时间的增加，吸光度值也在增加；当培养时间为18h时，其吸光度值达到最大；当培养时间大于18h时，其吸光度值随着培养时间的增加而下降，应是由于E. coli逐渐增加，培养物质逐渐匮乏而导致菌体活性下降所致。所以由实验可得，采用表面氧化技术制备的GO颗粒固定E. coli的最佳生长时间为18h，后续实验中均采用18h作为固定化时间。
Fig2.4 The curve of absorbance value changes depending on time spend of GO immobilized E. coli
图2.4 吸光度值随GO固定E. coli的反应时间变化曲线
2.5 不同的保存条件对E. coli活性的影响
将已经18h培养，收获的GO固定E. coli颗粒分别置于已灭菌的PBS溶液或原培养基中保存，用于保存的溶液必须完全浸没GO固定E. coli颗粒。分别于保存的1d-10d无间断的在两种保存条件下各随机选取4粒GO固定E. coli颗粒作为测试对象，采用如2.4所述光学方法检测E. coli的菌株活性。实验的结果如图2.5-1和2.5-2所示，同一保存条件下，吸光度值随着在K3[Fe(CN)]6体系中培养时间的延长而增加，说明增加培养时间可有效提高[Fe(CN)]64-的生成量；虽然经相同的K3[Fe(CN)]6体系培养1h、2h、3h和4h，但随着存储时间的增加，采用不同存储方式的GO固定E. coli颗粒产生的[Fe(CN)]64-的量均明显下降，表现为所对应的吸光度值与前一天相比均有所降低；此外，经相同的保存时间，相同的培养时间和培养条件，在培养基中保存的GO固定E. coli颗粒的活性优于PBS中保存的GO固定E. coli颗粒的活性，表现为培养基中保存的GO固定E. coli颗粒所产生的吸光度值更高。相对于单纯的PBS保存，培养基可持续供给固定化E. coli营养物质，所以，于培养液中保存的菌株活性持
续的时间较长。由实验结果可观察到，保存时间和保存条件均会对固定化E. coli的活性产生影响，因此在应用中应慎重选择微生物的保存方法，并明确规定保存时间。
Fig.2.5-1 The curve of absorbance value chan
ges depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in PBS solution at different storage time.
图2.5-1 经不同存储时间，存储于PBS溶液中的GO固定E. coli吸光度值随培养时间变化曲线
Fig2.5-2 The curve of absorbance value changes depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in culture at different storage time.
图2.5-2经不同存储时间，存储于培养基中的GO固定E. coli吸光度值随培养时间变化曲线
2.6 不同种类和浓度的药物对大肠杆菌活性的影响
分别选取阿米卡星，庆大霉素、左氧氟沙星、万古霉素、头孢噻肟钠考察GO固定E. coli对各类抗生素的灵敏度。阿米卡星的有效性检测：配制好母液800 mg/L，设置6个浓度梯度，即0mg/L 、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。分别吸取母液0mL、0.05mL、0.075mL、0.1mL、0.125mL、0.15mL于12个离心管中，每只离心管中再加入0.1mL 0.15g/LGGA、0.1mL 0.045mol/L K3[Fe(CN)6溶液，用采用灭菌的PBS缓冲溶液补齐培养液至1mL，每个浓度梯度设置2个样品。加入GO固定E. coli，置于恒温摇床中反应1h，稀释后补入FeCl3，制备普鲁士蓝溶液，用紫外分光光度计于700nm处测定其吸光度，求每个浓度梯度吸光度的平均值，进而监测E. coli的活性变化。
庆大霉素的有效性检测：配制好母液400mg/L，设置6个浓度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分别吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12个离心管中，每个浓度梯度设置2个样品，后续方法与阿米卡星的有效性测试方法相同。
左氧氟沙星的有效性检测：配置好母液400mg/L，分别设置6个浓度梯度，0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L。分别吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL于12个离心管中，每个浓度梯度设置2个样品，后续操作与上述阿米卡星有效性测试方法相同。
万古霉素的有效性检测：配制好母液400mg/L，设置6个浓度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分别吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12个离心管中，每个浓度梯度设置2个样品，后续操作与上述阿米卡星有效性测试方法相同。
头孢噻肟钠的有效性检测：配制好母液400mg/L,设置6个浓度梯度，即0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L。分别吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12个离心管中，每个浓度梯度设置2个样品，后续操作与上述阿米卡星有效性测试方法相同。
基于PB光学方法测定抗生素有效性的原理：当有抗生素药物存在时，大肠杆菌的呼
吸受到抑制，因而产生的[Fe(CN)]64-少于大肠杆菌正常呼吸所产生的电子，这表明PB生成量的多少取决于抗生素对微生物呼吸的抑制程度，所以可通过肉眼观察或利用可见光分光光度计测定吸光度以确定PB产量的减少，进而确定抗生素的有效性。
不同抗生素药物的抑制作用与E. coli的呼吸作用的关系用吸光度值变化率表示：
由图2.6.1-2.6.5可知，随着阿米卡星，庆大霉素、左氧氟沙星、万古霉素和头孢噻肟钠5种抗生素浓度的增加，其对细菌的抑制率也在不断增加。当达到半数抑菌率时，阿米卡星的浓度为12mg/L；庆大霉素为8mg/L；左氧氟沙星为10mg/L；头孢噻肟钠为3mg/L。但在0mg/L-10mg/L的测量浓度范围内，万古霉素的抑菌率均低于40%。根据药理作用，万古霉素主要用于葡萄球菌（包括耐青霉素和耐新青霉素株）和难辨梭状芽胞杆菌等致病菌所导致的疾病治疗，对厌氧菌和革兰氏阴性细菌效果并不明显，因此对E. coli的抑制作用较其它抗生素差。可见，本文研究的基于普鲁士蓝的光学测试方法不仅可有效区分各种抗生素类药物的靶向微生物，同时给出有效作用浓度。
Fig2.6-1 FDifferent concentrations of amikacin inhibition rate of e. coli activity
图2.6-1 图不同浓度的阿米卡星对大肠杆菌活性的抑制率
Fig2.6-2 Different concentrations of gentamicin inhibition rate of e. coli activity
图2.6-2 不同浓度的庆大霉素对大肠杆菌活性的抑制率
Fig2.6-3 Different concentrations of levofloxacin inhibition rate of e. coli activity
图2.6-3 不同浓度的左氧氟沙星对大肠杆菌活性的抑制率
Fig2.6-4 Different concentrations of vancomycin inhibition rate of e. coli activity
图2.6-4 不同浓度的万古霉素对大肠杆菌活性的抑制率
Fig2.6-5 Different concentrations of cefotaxime sodium inhibition rate of e. coli activity
图2.6-5 不同浓度的头孢噻肟钠对大肠杆菌活性的抑制率
3 分析和讨论
3.1 不同保存条件对大肠杆菌活性的影响
本文通过考察保存环境和保存时间对固定菌体活性的影响确定最佳保存条件。实验表明：经10d的保存周期，GO固定E. coli的活性随着时间的延长，其变化幅度逐渐减小；但是随着保存时间延长，相对于PBS中保存的固体颗粒，在培养基中保存的具有表面GO结构的石墨颗粒出现了融化的现象，可能是因为载体长时间放置在有机液态环境中，受到腐蚀所致。所以在进行此实验或在后续技术应用开发时应关注保存条件对GO固定E. coli的活性和颗粒完整度的整体影响，否则会造成结果的不准确。
3.2 大肠杆菌的浓度、培养时间和普鲁士蓝生成量的分析与讨论
据研究发现，K3[Fe(CN)6]的浓度过高将会对细胞的呼吸产生抑制作用，使细胞膜受到损
伤，所以在使用的时候应控制其浓度此外，K3[Fe(CN)6]的作用是接受微生物呼吸所产生的电子，需要考虑在培养时间内，其用量是否足够。因此，根据前期实验本文选用K3[Fe(CN)6]的浓度为45mmol L-1。在实验过程中，直接将同浓度的FeCl3与生成的[Fe(CN)6]4-混合时，会产生大量的普鲁士蓝沉淀。经研究发现，控制FeCl3与生成的[Fe(CN)6]4-的浓度为5mmol L-1时，生成的普鲁士蓝才能稳定存在，因此需要对培养液进行适当稀释，降低[Fe(CN)6]4-的浓度后，再添加FeCl3。同时，不同的培养时间所产生的[Fe(CN)6]4-的浓度是不一样的，随着反应时间的延长，[Fe(CN)6]4-的浓度会逐渐越大。当培养时间为1h，[Fe(CN)6]4-的浓度较小，当加入FeCl3时，没有出现明显的普鲁士蓝；当培养时间为2h时，由微生物呼吸作用所转移的电子增多，由此所生成的[Fe(CN)6]4-的浓度也相应增大，与FeCl3反应所生成的普鲁士蓝也比较明显；当培养时间增加至3h和4h时，加入FeCl3后溶液颜色明显加深，甚至出现了普鲁士蓝沉淀，因此需要提前稀释。可见，基于GO固定E. coli光学方法的建立还应充分考虑培养时间和生成[Fe(CN)6]4-的生成量，以确定合适的稀释浓度。
经微生物呼吸作用产生的K4[Fe(CN)6]不仅与培养时间有关，还与与E. coli的浓度和活性相关。本文通过建立吸光度随E. coli在具有表面GO结构的石墨颗粒上的培养时间的关系曲线，获得以下结论：第一，在16h之内，E. coli的活性随着时间的增大而增大；第二，E. coli的活性达增大至一定的程度后，会随着时间的增大而减小，因为提供给菌体的营养物质和生长空间有限，同时营养物的传导也会随着菌体的增加而受到限制；第三，16h可作为E. coli在具有表面GO结构的石墨颗粒上固定的最佳时间，在此培养时间下，E. coli出现活性的峰值，以便于通过呼吸作用转移更多的电子，生成更多的[Fe(CN)6]4-，当与FeCl3反应时能够呈现出明显的普鲁士蓝，增加测定的准确度和灵敏度。
4 结论
通过监测 [Fe(CN)6]4-浓度随培养时间的变化趋势，确定电子转移受体K3[Fe(CN)6]在4h培养时间内被还原量低于45mmol/L，但加入FeCl3后会引起沉淀，因此应对培养液进行适当稀释，保证[Fe(CN)6]4-的浓度低于5mmol/L；通过考察吸光度值随GO固定E. coli的反应时间的变化趋势，确定以LB培养基培养16h时，经GO固定的E. coli的活性最优；通过考察GO固定E. coli颗粒分别在LB培养基和PBS溶液中存储周期和活性关系，确定LB培养基更适合保存固定化E. coli，且随着存储周期的延长，E. coli的活性损失逐渐趋于平稳。将新鲜制备的GO固定E. coli颗粒用于检测阿米卡星，庆大霉素、左氧氟沙星、万古霉素和头孢噻肟钠5种抗生素，只
有万古霉素对菌株的活性抑制较弱，其余种可用于革兰氏阴性菌抗生素均表现出较好的抑菌作用。可见，本文所研究的基于GO固定E. coli的光学技术可有效区分抗生素的靶向作用微生物和有效性；营养物质对E. coli活性的保持尤其重要，为了确保技术的灵敏度和应用性，菌体储存过程中应注意营养物质的供给。因此，GO固定E. coli的光学技术在抗生素有效性检测实时监测和检测领域具有一定的应用价值。
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致 谢
在忙碌而充实的本科实习生活快要结束的时候，首先我要把我最诚挚的谢意和最崇高的敬意送给我的实习老师—刘畅副教授，感谢刘老师的辛勤耕耘，你的努力让我收获到了知识的果实，让我明白了知识的重量，让我拥有了严谨的科研态度。在实验的过程中也经历过失败，但刘老师深刻而细致的教导让我在不断探索中最终获得了实验的成功，完成了本科实习论文。其实这不仅仅是一份简单的本科实习论文，更重要的是包含了刘老师诲人不倦的指导，所以再一次诚挚的感谢刘老师。
感谢我的家人们在我本科实习阶段给与我的鼓励,关心和照顾。感谢爸爸妈妈给与我无微不至的关心与照顾，谢谢你们。
感谢我的同学韩笑、孙悦、在实习实
验及论文的写作中给予我的的热心帮助！
综述
基于微生物固定化技术的细菌耐药性检测方法的研究
1、微生物固定化技术
微生物固定化技术是20世纪发展起来的一项新兴技术，它利用物理或化学方法将游离微生物如真菌、细菌等限定在特定的空间内，保持生物活性并且可以多次循环使用。
1.1微生物固定化
随着工农业的快速发展，环境污染问题也变得日益严峻，污染范围越来越广，因此有必要发展更加简便、实用、高效且价廉的环境污染监测和治理的新方法。在此实际需要的基础上，就环境污染中的水污染这一方面开启了生物处理废水的研究，并且已发展成为有效治理水环境污染的一大热点。目前固定技术大致有共价结合法、吸附法、包埋法、交联法四种。
吸附法是一种传统的微生物固定方法，利用带电微生物与载体之间静电的相互作用使微生物细胞固定。传统的吸附载体包括活性炭和硅胶等物理吸附法。
共价结合法是将菌体活化，然后利用固定相载体表面与微生物细胞的表面功能基团（如羟基、酚羟基、咪?基、刘汲、羧基、氨基等）形成的共价键相结合，从而对细胞形成固定化。
交联固定法是利用多功能或双功能试剂，直接与微生物表面的反应基团发生化学交联，通过形成共价键来固定微生物，其彼此交联形成网状结构的固定化微生物，其结合力为共价键。常用的交联试剂有三羟甲基丙烷等。
包埋法是用物理方法将微生物细胞包埋在水不溶性的载体凝胶聚合物细孔的网状空间内。它能让产物更好的扩散，可以筛漏出杂质，还能阻止细胞的泄漏与流失。本文所使用的即是包埋法，这种方法的操作对微生物细胞的生物活性影响相对较小且操作的方法相对简单，而且其固定微生物细胞的强度高，所以其在目前的研究中具有非常广泛的应用。
3、细菌耐药性产生的原因和检测方法
细菌产生耐药性是为了适应生存环境所以产生了进化，也是药物治疗细菌感染疾病时不能避免所产生的。当抗菌药物与细菌接触的时候会因为各种反应机理来应对抗菌药物的抑菌作用，这时细菌的耐药性就产生了。细菌产生耐药性的原因可能是细菌本身所固有的，也有可能是获得性的，细菌可通过从其他耐药菌中获取耐药基因或者通过基因突变的方式而产生耐药基因。所以可将耐药菌分为固有耐药菌和获得性耐药菌。细菌可通过基因突变在后期对抗生素药物产生耐药，并且细菌在繁殖子代时可将耐药基因传给子代或者其它的菌株，所以细菌耐药性的精准迅速检测是指导我们正确使用抗生素的依据。通过抗生素的合理使用，可使细
菌的耐药性周期得到较好的延长，从而可保证抗生素的作用效果。检测细菌的耐药性方法包括传统的药敏试验(AST)、分子生物学技术、电化学方法和MTT比色法。其中分子生物学技术方法包括聚合酶链反应(PCR)、基因芯片和全基因组测序等技术。这些新型的研究方法在检测细菌的耐药性得到了迅猛的发展和较为全面的应用。
4、药物敏感性检测的原理
抗生素与人类疾病的治疗息息相关，所以其研究与开发受到人们的广泛关注。然而，由于滥用抗生素，出现了大量的耐药细菌，对我们的身体健康形成严重威胁，已成为当前不可回避的且急需解决的现实问题。耐药性细菌的出现导致疾病出现了不同程度的变异，所以给疾病的治疗带来了不同程度的困难且治疗耐药性细菌所导致的疾病也会带来巨大的经济负担。所以，为了解决这一问题，人们正在研究新的更快、更灵敏的检测方法。另外，研发抗菌药物，确定疾病以及测试剂量都离不开微生物的参与。所以要采用更快，更灵敏的药物敏感性实验方法来减少研究过程中人力和物力的大量投入。目前，应用最多的药物敏感性实验方法以及细菌耐药检测方法仍是纸片扩散法。这种方法虽然具有较高的准确度与较好的重现性，但检测过程需要大量的时间且操作过程复杂，需要浪费大量的人力物力，无法应对突发性事件。所以在检测细胞活性的众多方法中，光学方法的廉价以及简单受到了人们的追捧。
前人的研究结果发现，通过染料与细胞膜之间所产生的作用，可以很快速和简便的区分出活的细胞和死的细胞。例如中性红以及台盼蓝。通过这些染料穿透细胞膜来呈现出细胞的形态，展现出细胞的生命活力。
PB是亚铁氰化铁钾的配位化合物，它的生物之间的相容性是非常好的。PB在近红外区具有很强吸收和具有非常高的光和热的转换效率。这也使得PB在药物输运、分子影像、基因治疗、光热治疗肿瘤等研究领域受到越来越多人的关注。同时PB作为光学探针也为新的药物敏感性实验提供重要的依据。
实验选择的目标E. coli具有非常短的生命周期，对抗生素具有较好的敏感性且较易于分离纯化。利用光学检测方法的优势，让K3[Fe(CN)6]接受细菌呼吸过程中所产生的电子，然后以其生成物K4[Fe(CN)6]和FeCl3反应所产生的PB作为光学检测的探针，在700 nm处测定其吸光度，观察细菌生物体的活性是如何变化的，来检测抗生素的有效性。
5、本文研究内容及意义
目前，细菌耐药性的问题越来越严重，对临床治疗和患者的人身安全产生非常大的影响。尤其细菌感染是患者病死率高的一个重要原因。虽然体外菌株鉴定和药敏
实验为临床医生给细菌感染性疾病患者给以人性化的治疗提供了十分必要参考，在一定的程度上可以减少生病的时间、减少患者的医药费以及降低病死率，但由于从样本开始检验到获得药物敏感性实验报告的时间较长，一般需要两天以上，然而当药物敏感性实验报告产生误差时，可能会延误患者的治疗，以至于导致更严重的后果。所以要想得到更快速、结果更确切的药物敏感性实验报告，除了对收集细菌标本做出严格的要求以及规范细菌的鉴定和药物敏感性试验外，寻求更快速、简便和准确的药物敏感性实验方法也是十分重要的。
本实验以普鲁士蓝(PB)为光学探针进行吸光度的测定，以大肠杆菌为模型，用于筛选新的抗菌化合物以及对药物的有效性进行快速检测。通过对此方法的可行性进行分析，可得出大肠杆菌的浓度，营养物质以及培养时间对测定药物的有效性的影响，从而确定反应的最佳条件并将其用于抗菌药物的有效性检测，该试验的结果与传统的药物敏感性实验结果具有较好的吻合度。可能其灵敏度比不上肉汤稀释法，但是PB光学测定法的测定时间更短，适用于药物对细菌急性疗效的检测。
参考文献