Megazyme淀粉总量检测试剂盒
产品编号：K-TSTA（100次） (淀粉葡糖苷酶/α-淀粉酶方法) AOAC法996.11 /AACC法76.13改进版
1.简介
淀粉测定方法分为酸水解法和酶分析法。酸水解只能应用于纯淀粉样品。酶分析方法在前处理步骤，淀粉凝胶化、液化和糊化，糊精水解成葡萄糖、葡萄糖测定步骤等方面存在不同。AACC 76-11法采用淀粉在高压蒸汽灭菌锅中及含水的条件下凝胶化，并用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖，再测定葡萄糖含量。采用AACC 76-11法会导致许多样品和材料中（包括高直链淀粉玉米淀粉和谷物制品）淀粉含量检测结果偏低。目前，许多方法采用在淀粉凝胶化结束后立即加入耐热α-淀粉酶处理。对于难以凝胶化的样品如高直链淀粉玉米淀粉，用氢氧化钠或DMSO处理。在膳食纤维的测定方法中为确保淀粉完全溶解，Englyst和Cumming（1988）加入了淀粉脱支化酶，普鲁兰酶。
为了满足极端样品中总淀粉含量定量测定的需要，Megazyme公司研发出一种使用耐热α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的淀粉总量检测试剂盒。该方法已被AOAC和AACC采用。
近来，我们将检测方法进行了改进，使耐热α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶可以在相同的pH(pH 5.0)下进行孵育，这样简化了测定步骤，并将麦芽酮糖生成的可能性降到最低。
Megazyme淀粉总量试剂盒可测定大部分食品、饲料、植物和谷物制品（天然或加工过的）。对于大部分样品（如小麦粉），样品中的淀粉在孵育中（大约100℃，并加入耐热α-淀粉酶）会完全溶解。含有大量抗性淀粉的样品（如高直链玉米淀粉），需用2M KOH或热DMSO进行预溶解。含有可溶性淀粉或麦芽糊精的样品，不需要用耐热α-淀粉酶处理。 2.产品性能 ● ● ● ●
特异性：可用于测定α-葡聚糖（包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麦芽糊精）。
灵敏度：最小吸光度差异为0.10吸光度单位。这相当于当样品体积为1.00 mL时，D-葡萄糖的浓度为1.0mg/L或淀粉浓度为0.9 mg/L。
检测限：2.0 mg D-葡萄糖（1.8 mg淀粉）/L（在最大样品体积为1.00 mL，吸光度差异为0.020时得到）。
检测范围：5-100 ug D-葡萄糖，重复检测同一样品溶液,其吸光度值会有0.005-0.010吸光度单位的差异，这相当于样品体积为1.00 mL时，样品溶液中D-葡萄糖浓度0.05-1.0 mg/L。如果样品经过稀释，计算结果时需要乘以相应的稀释系数(F)，如果在样品制备阶段，样品称量时，如10g/L，可能会产生0.02 -0.05 g/100 g 的差异。 3.检测原理
耐热α-淀粉酶将淀粉水解为可溶性有支链和无支链的麦芽糊精(1)
(1) 淀粉 + H2O
(α-淀粉酶，pH7.0或5.0，100℃)
麦芽糊精
如果需要（如含大量抗性淀粉的样品），可向样品中加入的2M KOH并搅拌，在4℃下使抗性淀粉预溶解，然后用醋酸钠缓冲液中和，再用α-淀粉酶处理(2)。也可在100℃下，用的DMSO溶解。
(2) 抗性淀粉 + H2O
(KOH再中和 +α-淀粉酶)
麦芽糊精
淀粉葡糖苷酶（AMG）将麦芽糊精定量水解成D-葡萄糖(3)
(3) 麦芽糊精
(AMG)
D-葡萄糖
D-葡萄糖被氧化成D-葡萄酸盐，并释放一摩尔H2O2，再用过氧化物酶催化H2O2反应，产生的昆亚胺染料含量用比色法测定。
(4) D-葡萄糖+O2+ H2O
(葡萄糖氧化酶)
D-葡萄糖酸盐 + H2O2
(过氧化物酶)
(5) 2H2O2+对羟基苯甲酸+ 4-氨基安替比林 昆亚胺染料+ 4 H2O
如果样品中含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精，可在测定前用含水乙醇（80% v/v）处理。一个样品可以在70分钟完成。2小时内可以完成20个样品检测。 4.试剂盒组成
5.试剂溶液/悬浮液的制备
1)
瓶1：用30 mL 100 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0，试剂盒中没有提供，制备方法见6）稀释1.0 mL瓶1中的内容物。稀释的酶溶液要冷冻保存。可以分装于聚丙烯管中，-20℃保存，在使用过程中尽可能保持低温。-20℃保存，稳定性>3年。
注：如果样品根据AOAC官方方法996.11（案例b），此酶需用MOPS缓冲液稀释（50 mM, pH 7.0；制备方法见6）。 2) 3)
瓶2：瓶2中的产品可直接使用。该溶液有黏性，因此应用容积式移液器分装。4℃保存，稳定性>3年。
瓶3：用蒸馏水稀释瓶3（GOPOD试剂缓冲液）至1L，即为溶液3，立即使用。
注：如果GOPOD 试剂缓冲液保存于-20℃，可能会形成结晶盐，当缓冲液用蒸馏水稀释至1L时，结晶盐会完全溶解；此浓缩缓冲液含有叠氮化钠（0.4%W/V），请注意。 4)
瓶4: 取20mL溶液3溶解瓶4中的产品，全部转移至装有剩余溶液3的瓶子中，混匀（~1L）。用铝箔封盖瓶子以遮光保存，即为葡萄糖测定试剂（GOPOD试剂），在2-5℃可以保存3个月，在-20℃下可以保存一年。如果-20℃储存时，应分装后再冻存。如果是新鲜制备的试剂，应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月会变成深粉色。当以蒸馏水为对照时，该溶液的吸光度应小于0.05。 5)
瓶5&6：瓶5或6中的产品可直接使用。室温下稳定性>5年。
6.其他试剂制备 (试剂盒不提供)
试剂1 醋酸钠缓冲液 (100 mM, pH 5.0) 加氯化钙(5 mM)
1) 2) 3)
加5.8 mL冰醋酸（1.05g/mL）至900 mL蒸馏水中。滴加1M氢氧化钠溶液（4g/100mL）调节pH值至 5.0（约需要30mL）。4℃保存稳定性约2个月。
加入0.74g二水氯化钙并溶解。定容至1L，4℃保存，稳定性约6个月。
可加入叠氮化钠增加此缓冲液的稳定性（0.2g叠氮化钠/L缓冲液）。室温保存稳定性约2年。
注: pH调节完毕后，再加叠氮化钠。叠氮化钠在酸化条件下会释放有毒气体。 试剂2 醋酸钠缓冲液 (1.2M, pH 3.8)
加69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）至800 mL蒸馏水中。滴加4M氢氧化钠溶液调节pH值至 3.8，用蒸馏水调节体积至1L，室温保存稳定性约12个月。 试剂3 氢氧化钾溶液（2M）
加入112.2g KOH至900mL去离子水中，搅拌溶解。调节体积至1L。密闭容器中保存。室温保存稳定性>2年。
试剂4 MOPS 缓冲液 (50 mM, pH 7.0) 加 氯化钙(5 mM) 和叠氮化钠 (0.02 % w/v) ，只有在样品制备案例（b）的检测中需要此缓冲液。
用900 mL蒸馏水溶解11.55 g MOPS (钠盐，Sigma 货号 M-9381)，用1 M (10 % v/v) HCl (大约需要 17 mL) 将溶液的pH调至7.0。加0.74 g 二水氯化钙和0.2 g 叠氮化钠并溶解。定容至1 L。4°C保存，稳定性为6个月。
试剂5 醋酸钠缓冲液 (200 mM, pH 4.5) 加叠氮化钠(0.02 % w/v) ，只有在样品制备案例（b）的检测中需要此缓冲液。
将11.6 mL 冰醋酸 (1.05 g/mL)加入900 mL 蒸馏水中。滴加1 M(4 g/100 mL)氢氧化钠溶液（大约需要60mL）将pH调至4.5 。加0.2 g 叠氮化钠，溶解。定容至1 L。4°C保存，稳定性为6个月。
注: pH调节完毕后，再加叠氮化钠。叠氮化钠在酸化条件下会释放有毒气体。 7.仪器及设备（推荐）
1) 2) 3)
玻璃试管 (圆底; 16 x 120 mm或者18 x 150 mm)。 微量移液器, 100μL 容积式移液器
配有50mL管嘴，以分装3mL的细菌性α-淀粉酶溶液。 配有5.0mL管嘴，以分装0.1mL的淀粉葡糖苷酶溶液。 4) 5) 6) 7) 8) 9)
台式离心机 (3,000 rpm; 大约1,800g)。 分析天平
分光光度计：设置为510nm 漩涡震荡器
恒温水浴锅：设置为50.0°C 沸水浴锅和试管夹
10) 定时器 8.检测方法
测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量(推荐方法，所有孵育均在pH5.0下进行) 1) 2) 3) 4)
将谷物，植物或食品磨成可以通过0.5mm筛网的粉末。
将粉状样品(准确称量100 mg)加入到试管中(16x120 mm)，拍打试管以确保全部样品位于试管底部。
加入0.2 mL乙醇溶液(80% v/v)使样品润湿并有助于分散，用漩涡混合器混匀。
立即加入3 mL 耐热α-淀粉酶（1：30稀释于试剂1的瓶1中的内容物）, 试剂1为醋酸钠缓冲液 (100 mM, pH 5.0)。沸水孵育试管6分钟（孵育2分钟，4分钟和6分钟时振荡试管)。 注: 这一步中强力振荡的目的是确保样品能完全混匀，防止结块。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管；如果使用的是聚丙烯管，可增加孵育时间至12分钟，在4，8和12分钟时振荡。 5) 6)
将试管放置于50°C的水浴锅中，然后加入0.1 mL瓶2中的内容物（淀粉葡糖苷酶），涡旋混匀，在50°C下孵育30分钟。
将试管中全部的溶液转移到100 mL的容量瓶中（使用漏斗有助于转移）。用洗瓶彻底漂洗试管,并将洗液倒入容量瓶中，然后用蒸馏水调整溶液体积，充分混匀。取单位体积溶液离心(3,000 rpm,10分钟)，使用清澈、未稀释的溶液检测。
或者,在第6步，用蒸馏水调节体积至10mL，然后3,000 rpm离心10分钟。对于含有1-10%淀粉的样品，该溶液可以直接进行第7步。对于含10-100%淀粉的样品，用蒸馏水将1.0mL单位体积的样品稀释到10mL再进行第7步。 7) 8) 9)
取两份稀释的单位体积的样品溶液(0.1 mL)分别转移到圆底试管中(16 x 100 mm)。
取3.0 mL GOPOD试剂加到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白)，然后在50°C下孵育20分钟。
葡萄糖对照包括0.1 mL葡萄糖标准溶液(1 mg/mL) + 3.0 mL GOPOD试剂。试剂空白溶液包括0.1 mL水和3.0 mL GOPOD 试剂。
10) 在510 nm下测定每一个样品和葡萄糖对照相对于试剂空白的吸光度值。
● 测定不含抗性淀粉，D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量(AOAC官方方法996.11) 1) 2) 3) 4)
将谷物，植物或食品磨成可以通过0.5 mm 筛网的粉末。
将粉状样品(准确称量~100 mg)加入到试管中(16x120 mm)，拍打试管以确保全部样品位于试管底部。
加入0.2 mL乙醇溶液(80% v/v)使样品润湿并有助于分散，用漩涡混合器混匀。
立即加入3 mL 耐热α-淀粉酶(1:30稀释于试剂4；50 mM MOPS缓冲液，pH 7.0)，沸水浴中孵育6分钟（孵育2分钟，4分钟和6分钟时振荡试管)。
注意: 在这一步中通过强力振荡的目的是确保样品能完全的混匀，防止结块。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用的是聚丙烯管，可增加孵育时间至12分钟，在4，8和12分钟振荡。 5) 6)
将试管放置于50°C的水浴锅中，加入醋酸钠缓冲液（4mL,200mM, pH 4.5）,然后加入淀粉葡糖苷酶瓶2中的产品（0.1 mL, 20U），涡旋混匀，在50°C下孵育30分钟。
按照“测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”步骤6及以后的步骤继续进行检测。
● 测定含有抗性淀粉但不含D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品中总淀粉含量（KOH法-推荐） 1) 2) 3) 4)
将谷物，植物或食品磨成可以通过0.5 mm 筛网的粉末。 将粉状样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120 mm)。
加入0.2 mL乙醇溶液(80% v/v)使样品润湿并有助于分散，用漩涡混合器混匀。
将试管冰浴，再向每个试管中加入磁力搅拌棒（5×15mm）和2 mL 2M的KOH，用磁力搅拌机在冰浴状态下搅拌20min，以重悬浮絮状物和溶解RS。
注：不要使用涡旋器混匀，那将会导致淀粉乳化。确保边加入KOH溶液边剧烈搅拌试管里的样品。这将会避免形成难溶的淀粉块。 5) 6) 7)
向每个试管加入8 mL的1.2M醋酸钠缓冲液（pH3.8），并用磁力搅拌机搅拌。立即加入0.1 mL的耐热α-淀粉酶（瓶1）和0.1mL的AMG(瓶2)，混匀，再将试管置于50℃水浴中。 孵育试管30分钟，并用涡旋混合器间歇性搅拌。 对于总淀粉含量>10%的样品
用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶，当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒。用蒸馏水定容至100mL，并混匀。离心单位体积溶液，1800g，10分钟。 8)
对于含有>10%总淀粉含量的样品
直接离心1800g，10分钟（非稀释）。对于这些的样品，试管里的最终体积大约为10.4mL（体积可能会变化，如果分析的是湿样，在计算数值时应注意折扣）。 9)
按照“测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”步骤7及以后的步骤继续进行检测。
● 测定含有抗性淀粉但不含D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品中总淀粉含量（DMSO法-AOAC 官方方法996.11） 1) 2) 3) 4) 5)
将谷物，植物或食品磨成可以通过0.5 mm 筛网的粉末。 将粉状样品(准确称量~100 mg)加入到试管中(16x120 mm)。
加入0.2 mL乙醇溶液(80% v/v)使样品润湿并有助于分散，用漩涡混合器混匀。
立即加入2 mL DMSO并用涡旋混合器搅拌。将试管放置于剧烈沸腾水浴中，5分钟后取出 按照“测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”或“测定
不含抗性淀粉，D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”步骤4及以后步骤继续进行检测。
●
测定含有D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品中淀粉含量 1) 2) 3) 4) 5) 6)
将谷物，植物或食品磨成可以通过0.5 mm 筛网的粉末。
将粉状样品(准确称量~100 mg)加入到试管 (16x120 mm；17 mL容量)中。
加入5.0 mL乙醇溶液(80% v/v)，在80-85°C下孵育5分钟。用漩涡混合器充分混合，再一次加入5.0 mL乙醇溶液(80% v/v) 。
1800g离心10分钟(或3,000 rpm)，弃上清。
加10 mL 80% 乙醇溶液重悬沉淀，漩涡振荡器混合。按上步条件离心，小心弃上清。 按照“测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”或“测定不含抗性淀粉，D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量”步骤4及以后步骤继续进行检测。如果样品中含有抗性淀粉，可按照：测定含有抗性淀粉但不含D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品中总淀粉含量“步骤4及以后的步骤继续进行检测。
●
测定淀粉以可溶形式存在并D-葡萄糖和/或麦芽糊精不存在的样品中的淀粉含量 1) 2) 3) 4)
用Whatman No1滤纸（如有必要可用Whatman GF/A 玻璃纤维滤纸）过滤单位体积样品溶液。采用清澈滤液用于分析。
将10mL滤液加入至试管。加入2mL试剂1（100mM醋酸钠缓冲液，pH5.0）加0.1mL的AMG(瓶2)，50°C水浴30分钟。用蒸馏水调节体积至20mL（或20 g） 移取单位体积（如0.1mL）稀释溶液至玻璃试管底部（16×100 mm）(复样)
取3.0 mL GOPOD试剂加到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白)，然后在50°C下孵育20分钟。葡萄糖对照包括0.1 mL葡萄糖标准溶液(1 mg/mL) + 3.0 mL GOPOD试剂。试剂空白溶液包括0.1 mL水和3.0 mL GOPOD 试剂。 5) ●
1) 2) 3)
在510 nm下测定每一个样品和葡萄糖对照相对于试剂空白的吸光度值。
用Whatman No1滤纸（如有必要可用Whatman GF/A 玻璃纤维滤纸）过滤单位体积样品溶液。采用清澈滤液用于分析。
加入2mL待分析的滤液至17 mL玻璃试管。再加入8 mL95%v/v乙醇，用涡旋混匀器剧烈混合。室温直立放置30分钟，1800g离心10分钟。
小心倒出上清液，用1mL蒸馏水重新溶解含淀粉的絮状物。如果有必要，沸水浴以有助于重新溶解。用试剂1（100mM醋酸钠缓冲液，pH5.0）调节体积至3.9 mL，要考虑到试管的原始重量。 4)
如样品中含有高含量的游离的D-葡萄糖和/或麦芽糊精，有必要重复乙醇沉淀和离心步骤。小心倒出上清液，用1mL蒸馏水重新溶解含淀粉的絮状物。如果有必要，沸水浴以有助于重新溶解。用水调节体积至3.9mL（3.9g），要考虑到试管的原始重量 5) 6) 7) 8) 9) 加入0.1mL的AMG(瓶2)，50倍稀释于试剂1，50℃水浴孵育30分钟 移取单位体积（如0.1mL）稀释溶液至玻璃试管底部（16×100 mm）(复样)
取3.0 mL GOPOD试剂加到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白)，然后在50°C下孵育20分钟。
葡萄糖对照包括0.1 mL葡萄糖标准溶液(1 mg/mL) + 3.0 mL GOPOD试剂。试剂空白溶液包括0.1 mL水和3.0 mL GOPOD 试剂。
在510 nm下测定每一个样品和葡萄糖对照相对于试剂空白的吸光度值。 测定淀粉以可溶形式存在并D-葡萄糖和/或麦芽糊精也存在的样品中的淀粉含量
9.结果计算
固体样品：
淀粉，% = △A x F x
FV
0.1
x
1 1000
x 100 W
x 162
180
= △A x F x FV x 0.9
W
A = 相当于试剂空白读取的吸光光度值(反应) F = 吸光光度值转换为葡萄糖（μg）的因子
= 100 (D-葡萄糖的重量µg) 100 µg D-葡萄糖的吸光光度值
FV =最终体积（如在案例（a）和（b）等于100mL或10mL;案例（c）中100或10.4 mL；案例（d）中等于100mL或10.0mL；案例（e）中等于100mL或10mL） 0.1 =用于检测的样品体积
11000
= 1从μg到mg的转换
= 一定重量干粉中淀粉含量以百分比表述的因子
=淀粉中游离的D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酐的的因子
100 W 162 180
淀粉%W/W(干重)
=淀粉%W/W（上述算法结果）
计算（液体样品；mg/100mL） 淀粉
= △A x F x
100 0.1
= △A x F x D x 1.8
x
x
100
100 - 含水量（%W/W）
1
x
162
x
2
x D
1000 180
A = 相当于试剂空白读取的吸光光度值(反应) F
=
100 (D-葡萄糖的重量µg)
100 µg D-葡萄糖的吸光光度值 100 =样品体积转换到100mL 0.1 =用于检测的样品体积 1
= 吸光光度值转换为葡萄糖（μg）的因子
= 从μg到mg的转换
1000
162 180
=淀粉中游离的D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酐的的因子
2 =在用AMG孵育时样品溶液的稀释 D =孵育混合物的进一步稀释（如果有需要）
10．注意事项
1) 2)
GOPOD试剂的孵育时间没有严格规定，但至少应为20分钟，并在60分钟内测定吸光度值。 每次试验必须设定反应空白和葡萄糖对照(100μg, 4复样) 。反应空白包括 0.1 mL 蒸馏水 + 3.0 mL GOPOD试剂；葡萄糖对照包括0.1 mL葡萄糖标准溶液 (100 µg/0.1 mL) + 3.0 mL GOPOD 试剂。 3) 4) 5) 6)
稀释因子“F”的计算是通过标准检测中D-葡萄糖的量（100 µg）除以这些量的D-葡萄糖获得的吸光度值得到，如（100/1.038=96.386）。吸光度值可能会变化。 每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品。
每使用一批新的GOPOD溶液，必须验证其与100μg葡萄糖标准反应产生最终颜色所需要的时间，通常约为15分钟。
样品空白按照标准试验程序[测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的谷物制品和食品中的淀粉含量]进行检测，将第4步修正为添加3mL蒸馏水，第5步中用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶。也可以用酒精(80%v/v)预提取样品避免设置样品空白，参见测定含有D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品中淀粉含量。 7)
如果在实验规定的时间内(约5分钟)完成D-葡萄糖转化过程,通常认为没有干扰发生。这可以进一步验证，通过在实验的完成时，向比色皿中加入D-葡萄糖(0.1mL中加入50 ug)，吸光光度值有会明显增加。
通过加入内标物可以对样品中的干扰物质进行鉴定。定量回收试验:通过向样品中添加内标物,计算样品在处理和提取时的损失。如在最初的提取步骤时加入D-葡萄糖。 8)
D-葡萄糖检测所用的试剂不含有毒物质。但是，浓缩的缓冲液中含有防腐剂叠氮化钠(0.02 % w/v)，因此应该遵守适用于所有化学物质的一般安全措施。