细胞工程 课程论文
论文题目：猕猴桃的快速繁殖
指导老师： xxx 学生姓名：xxx
学 号： xxxxxxxxxx
专 业：xxxxxxxxxx
二〇一三年6月
猕猴桃的快速繁殖
（华中师范大学 生命科学学院 王娅妮，武汉 430079）
摘 要：
“华特”和“红阳”猕猴桃作为稀有珍贵品种, 具有广阔的市场前景和开发利用价值。我们以猕猴桃为试材，可以通过对其植株顶芽、带腋芽茎段、叶片、叶柄、果实和根段等多种外植体的离体培养，研究其诱导成苗、幼苗增殖、生根移栽技术，建立猕猴桃快速繁殖体系。
关 键 词：
“华特” “红阳” 离体培养 生根 愈伤组织 快速繁殖
一、 引言
猕猴桃营养丰富，被誉为“水果之王”，以富含Vc 和风味独特而深受人们喜爱。 猕猴桃大多是雌雄异株，采用种子繁育，周期长，且较难鉴别幼株性别，不易获得大批雌株群体；而利用扦插、嫁接的方法，成活率较低。与其他育苗方式相比，组织培养不但能周年供苗，而且成本低廉。1975年Hirsch21首次以猕猴桃茎段为材料，进行离体培养，并对培养材料进行了氨基酸代谢的研究，为猕猴桃组织培养的研究工作揭开了序幕，但由于猕猴桃不同品种问存在基因型差异，因此需要针对某一个品种来筛选适宜的培养基配方。
二、 实验原理 植物细胞具有全能性，可以进行组织培养。
三、 实验材料
1、实验材料
新鲜猕猴桃，于晴天不浇水时采取猕猴桃茎段（外植体）。
2、实验仪器 超净工作台、70%酒精、0.1%升汞、无菌水、剪刀、镊子、解剖刀、培养基、培养皿、无菌滤纸、三角瓶、打火机、酒精灯、75%酒精、封口膜。
四、 实验操作
1. 外植体消毒
将采集来的猕猴桃幼嫩茎段用自来水冲洗2 h。清洗干净后移入无菌操作台用体积分数75%乙醇浸泡30 s， 无菌水清洗3次， 放入含有1 滴吐温80的1 mg/ L 升汞溶液中表面消毒7 min（不停振荡），消毒完成后无菌水清洗5 次。将茎段切割成长度为0.5 cm 的小段，横向切成两半，背面划出几道伤口，髓部朝下接种在诱导培养基上。
2. 愈伤组织的诱导和不定芽的分化
诱导和分化培养均以MS 为基本培养基， 添加质量分数0.60％的琼脂、质量分数3％的蔗糖、0.1 mg
/ L 的NAA ， 以及不同浓度的6－BA （0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg / L） 或ZT （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg / L）， 调节pH 为5.8， 考察激素种类和浓度对愈伤组织出愈率及不定芽出芽率的影响。
每个配方接种10 瓶，每瓶接种3 个茎段外植体，于25 ℃暗培养，20、30 d 时分别统计茎段愈伤组织诱导率。30 d 后将长出的愈伤组织转接在新的培养基中进行分化培养，培养条件为25 ℃、光照时间12 h / d、光通量2 500 lx，30 d 后统计不定芽的形成情况以及每块愈伤组织上不定芽的个数，计算增殖系数。
增殖系数＝各处理不定芽的总数/ 愈伤组织的总块数
3．诱导生根
可采用瓶内生根和瓶外生根的方法促进试管苗根系发生及其功能的恢复。
（1）瓶内生根：生根培养以1 / 2MS 为基本培养基，附加质量分数0.55％的琼脂、质量分数2％的蔗糖、质量分数0.3％的活性炭，添加不同浓度的IBA （0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mg / L）。每个配方设置6 个重复，每瓶接入高2 cm 左右的健壮不定芽5 个，25 ℃暗培养3 d 之后光照培养，光照时间为12 h / d，光通量为2 500 lx，培养30 d 后观察不定芽的生根情况。
平均生根数＝各处理所有不定芽的生根总数/不定芽个数。生根率＝生根的不定芽个数/ 不定芽总数
（2）瓶外生根：将切下的猕猴桃新梢在IBA 溶液（不需灭菌）中浸泡约lh ，然后直接移人装有细沙并淋透了已稀释10倍的MS 培养基的大量元素营养母液的小花盆中，并在其上扣上透光通气且保湿的大号培养皿，以防此时柔弱的无根苗因失水而枯死。约1周后即可发现在苗的基部出现几个白色的不定根突起，随后根逐渐延伸并长人沙土中吸收水分和养分。
瓶外生根法可将生根及对苗的驯化（炼苗）结合起来，它既可降低育苗成本，又可提高移栽成活率，且简化了育苗程序，因而也更具有推广应用价值。
4 .炼苗和移栽
组培室内将瓶盖拧松(但不揭开) ，进行生根苗炼苗，7 d后移出培养瓶，自来水洗去根部附着的培养基，移栽温室，遮荫、保持基质湿润，控制温度为(27±2) ℃，空气湿度90％以上。其余常规管理。移栽基质为V(珍珠岩) ：V(泥炭)=1：2，拌匀两种基质成分，用1200倍甲基托布津稀释液喷浇基质，晾干后使用。
将已生根的小苗移入大棚，不松瓶盖炼苗7 d， 打开瓶盖接触外界环境炼苗3～4d ，清水洗净苗木基部的培养基，移栽在基质中（泥炭土与珍珠岩体积比为2∶1），遮荫，保持基质湿润，温度控制在27 ℃左右，其余常规管理。
五、结果与讨论
1、激素浓度对愈伤组织和不定芽分化的影响
愈伤组织诱导和不定芽分化培养基中添加不同浓度的6－BA 或ZT 来观察激素浓度对愈伤组织和不定芽分化的影响。
有实验表明：茎段极易形成愈伤组织，各配方培养基中培养30 d 后诱导率均可达到100％，且愈伤组织均生长良好，颜色为黄绿色。实验中发现，与添加相同浓度的6－BA 相比，MS 中添加ZT 时愈伤组织诱导时间短、出愈率高，不定芽的分化率也较高。其中MS ＋0.8 mg / L ZT＋0.1mg / L NAA 处理所需诱导时间最短，且获得的愈伤组织极易分化出苗，不定芽的出芽率也最高，生长良好。
2、 不同浓度的IBA 对猕猴桃生根的影响
将高度为2 cm 左右的不定芽接种在含不同浓度IBA 的生根培养基中，不定芽基部略微膨大，切口处有少量愈伤组织形成，10 d 左右开始生根，根为白色，健壮、长势良好。
有实验表明：从生根率来看，IBA 浓度在0.5 mg / L 时最有利于根的产生，生根率达到93.33％。
3、炼苗移栽结果
不定芽生根培养25～30 d 后便可转入温室，不松瓶盖炼苗7 d，打开瓶盖炼苗3～4 d，用自来水将根系上的培养基清洗干净后移栽到装有混合基质的穴盘中保温保湿培养，3 d 后幼苗即可伸展，10 d后可适当降低湿度和水分供应，每周浇灌复合肥一次，移栽成活率可高达96.07％。移栽后苗木生长良好，叶色饱满正常、呈鲜绿色，各性状也较为稳定
六、结束语
以猕猴桃茎段为外植体，通过组织培养诱导愈伤组织的形成和不定芽的分化，获得了再生植株。 实验中发现，猕猴桃茎段材料在含有NAA 、不同浓度的6－BA 或ZT 的MS 培养基培养30 d 后出愈率均达到100％，说明该材料极易形成愈伤组织。并且还发现ZT 有利于猕猴桃愈伤组织的增殖和分化，考虑到ZT 市场价格高昂，生产中可采用6－BA 代替ZT 。有学者在猕猴桃嫩梢增殖实验研究中发现用侧芽比茎段更易形成愈伤组织，分化出芽的遗传变异性相对较小、种性稳定、植株整齐。
参考文献：
【1】 隆前进，猕猴桃组织培养和快繁技术研究，浙江师范大学2010植物学硕士毕业论文；
【2】 阳小成，车晓彦等，中华猕猴桃的组织培养及其实用快速繁殖，重庆大学学报：自然科学
版.2002.25(6).-75-77；
【3】 朱学栋，刘奕清，赵荣隆，袁海英，吴林，红阳猕猴桃快速繁殖体系的建立，第51 卷第11 期 2012
年6 月湖北农业科学Hubei Agricultural Sciences
【4】 隆前进，吴延军，谢鸣，红阳猕猴桃叶片和带芽茎段的组织培养快繁技术, 浙江农业学报Acta
Agriculturae Zhejiangensis 22(4)：429～432，2010