《环境微生物新技术》课程作业
2.微生物数量测定方法有哪些？空气、水、土壤样品分别适用哪些方法？请举例说明。
常见微生物数量的测定方法
1.计数器测定法：
即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法 :
常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法
此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
6、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。
7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）
通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例单介绍其操作：
（1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。
（2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管
（3）于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数或做片在显微镜下数，均称为显微镜直接计数法。 用琼脂平板计数，称为菌落计数法 。
一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。
微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大类，由于多数微生物的个体较小，肉眼无法观察 ，对其计数一般比较困难。在目前的微生物实验教学,对微生物计数的方法主要有三大类：总细胞计数法、活细胞计数法和微生物生长量测定法 。并不是每一种方法都是通用的 ,不同的微生物种类需要不同的计数方法 , 目前多用以下8种方法进行计数：
1.总细胞计数法
1.1 血细胞计数板计数法 血细胞计数板是一块特制的载玻片 ,其上划有计数室 ,通过对计数室中的微生物数量的读取 ,计算原溶液中的微生物数量。此方法由于计数板较厚,且计数室的高度是0.1mm ,不能采用油镜进行观察,故只能对体积较大的真核微生物进行测定 ,如酵母菌、霉菌抱子等,只能测得所有细胞的总数,不能区别死细胞和活细胞,尤其是对运动能力强的活细胞难以计数。
目前已经提出一些方法,如结合特定的美蓝染色技术,区别酵母菌死活细胞,将运动的细胞加人甲醛溶液中,破坏其运动以便计数等。
1.2 细菌计数板计数法 细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而来 ,主要是降低计数板的厚度 ,同时将计数室的高度从0.1mm降低到0.02mm ,以用油镜对较小的原核微生物进行计数。
1.3 膜过滤计数法 利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确 ,但当样品中细菌的数量很低时 ,如湖水、海水或饮用水等 ,用膜过滤计数法更精确些 ,可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色 ,再用
0.02um的聚偏二氟乙烯膜负压过滤 ,再用无菌水冲洗至无色后 ,将过滤的膜进行抽干 ,将膜放到载玻片上,滴加甘油 ,盖上盖玻片 ,即可在显微镜下计数。一般随机抽取20个视野进行计数 ,最后算平均数 ,计算整个滤膜上的菌的数量 ,得到原菌液中的微生物数量。
此测定方法一般只能用于样品中细菌数量很低的情况 ,多数时候细菌个体由于粘附成团而影响结果。所以 ,过滤前的细胞分散处理很重要 ,例如将细菌悬液经过酸碱或超声波处理 ,将聚团的细胞打散 , 可以增加此方法的准确性。
2.活细胞计数法
2.1 平板菌落计数法 平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量 ,但是操作过程相对计数板而言复杂一些 ,而且测得的细菌数量往往小于实际值。 主要原因是在计算细菌浓度时 ,往往每个菌落并不一定是由一个单细胞生长繁殖而来 ,有可能是2个或多个,致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低 ,这也就是为什么现在都用菌落形成单位数（cfu/mL）来取代过去的绝对细菌数量。为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的数量值 , 目前多数办法是:尽量扩大稀释倍数 ,涂布平板时少取稀释菌液 ,使平板中的菌落数减少,避免由于菌液中细菌数过多造成多个细菌形成一个菌落。例如 ,将系列梯度稀释至 10-8或更低(稀释倍数取决于原菌液)。
2.2 比浊法 微生物细胞在一定浓度范围内 ,与浊度成正比 ,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大。故可通过分光光度计测定吸光值 ,通常测定600nm下的吸光值OD600 ,通过与标准曲线对比 ,求出样品
中菌液浓度 ,计算出细胞的数量。
实验测定时容易出现误差 ,必须控制菌浓度在与光密度成正比的线性范围内 ,否则不准确。
2.3 霉菌计数法 对于霉菌的计数一般比较困难 , 由于霉菌生长快、菌丝叠加导致无法准确计数。国标霉菌计数法的原理是将待测菌液进行10倍梯度系列稀释 ,利用高盐察氏培养基(CAO)与待测菌液混匀后倒平板 ,25℃~28(土1) ℃下培养3d后开始计数 ,选择菌落数在 10－150之间的平板进行计数 ,取同稀释度的两个平板的菌落平均数乘以稀释倍数 , 即为每g(或ml)检样中所含霉菌数。
3.微生物生长量测定法
3.1 凯氏定氮计数法 蛋白质是微生物细胞的主要成分 ,含量较稳定 ,可以通过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量 ,将细胞洗涤收集 ,用凯氏定氮法测全氮 ,蛋白质含氮量为16%,细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别 ,平均值为65%, 根据每一种微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待侧样品中细胞的总质量 ,最后根据单个细胞的质量计算出样品的细胞数量。
总含氮量与蛋白质之间的关系为：蛋白质总量=含氮量÷16% ,那么 ,微生物细胞总质量=蛋白质总量÷65%，微生物细胞总数=细胞总质量÷单个细胞质量。每一种微生物细胞的蛋白质含量不同 ,且不同时期的细胞蛋白质含量、单个细胞的质量都有差别 ,所以用此方法测定的结果误差较大 ,只能作为参考。
3.2 DNA含量测定法 相比凯氏定氮计数法较大误差，DNA含量测定法相对较准确。 每个微生物细胞的DNA含量非常恒定 ,平均为
8.4×10-5ng ,将一定体积的细菌悬液离心 ,从细菌细胞中提取DNA , 得其重量,则可计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。
总结：
本文对常用的8种微生物数量测定方法进行总结与比较 ,血细胞计数板和细菌计数板常用于测定单细胞或孢子 ,相对比较准确；膜过滤用于测定细胞浓度很低的样品 ,平板菌落计数对多数微生物的测定都适用 ,但是相对其他计数法要复杂；比浊法相对准确 ,但需要标准曲线；对于丝状微生物的数量测定 , 国际上有明确的标准，而凯氏定氮法和DNA含量测定法都是通过对微生物细胞内含量相对稳定的物质进行定量测定 , 再算出细胞的数量 ,操作相对复杂。
环境中的微生物数量测定方法
一、空气中：
空气中没有可为微生物直接利用的营养物质和足够的水分，它不是微生物生长繁殖的天然环境，因此空气中没有固定的微生物种类。它主要通过土壤尘埃、小水滴、人和动物体表的干燥脱落物、呼吸道的排泄物等方式被带入空气。由于微生物能产生各种休眠体，故可在空气中存活相当长的时期而不至死亡。
空气中微生物的种类，主要为真菌和细菌。其数量则取决于所处的环境和飞扬的尘埃量。
1.自然沉降法（沉降平板法）
根据空气中携有微生物气溶胶粒子在地心引力作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上，经24h,37℃温箱培养计算菌落数。
根据奥梅梁斯基建议，面积为100cm2的平板培养基，暴露于空气中5min,于37℃温箱培养24h后所生长的菌落数相当于10L空气中的细菌数。
空气中的细菌数（cfu/m3）=1000×{（100/A）×(5/t)×(1/10)}×N =50000N/(A×T)
A----平板面积cm2；T----暴露时间min；N----平均菌落数(cfu/皿)
特点：简单方便，但稳定性差，直径1~5um的粒子在5min内沉降距离有限，使小粒子采集效率低。
2.撞击法
Anderson采样器原理：多级筛孔型采样器
由6个带有微细针孔的金属撞击盘构成，盘下放置有培养基的平皿，每个圆盘上有400个环形排列小孔，由上到下孔径逐渐减小。气流从顶罩进第一级，较小的粒子会由于动量不足随气流绕过平皿进入下一级。经6次撞击后，可把绝大部分的微生物采集下。
空气含菌量(cfu/m3)=【六级采样板的总菌数(cfu)÷28.3(L/min)×采样时间(min)】×1000
特点：a.采集粒谱范围广，一般在0.2~20um以上； b.采集效率高，逃逸少；c.微生物存活率高。
3.过滤法
使一定量的空气通过吸附剂（灭菌生理盐水），然后培养吸附剂
中的细菌，计算出菌落数。
4.液体撞击法
和固体撞击式采样器一样，是利用喷射气流方式将空气中的微生物粒子采集到小体积液体中，适用于高浓度的空气微生物采样。
二、水样中：
（1）水样中细菌总数的测定
1.直接计数法－－血球计数板计数
利用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的微生物计数法。此法是将待测细菌菌悬液或孢子液置于计数板的计数室中，由于计数室的容积是已知的，并有一定的刻度，因此可以根据在显微镜下观察到的微生物个体数计算出单位体积内微生物的总数。该法只适用于计算形态较大的酵母菌、藻类及孢子等。
２.染色涂片计数法
此法是利用涂片面积与视野面积之比来计算出样品中微生物量。取稀释定容的菌液，滴在载玻片上并均匀涂布在一定面积上，经固定染色后，在显微镜下借相同倍数标定过的目测微尺，测得视野半径计算出视野面积，从已知总面积计算出视野总数。根据几个视野中的细胞平均值，计算出１ｍＬ样品中的细菌数。
3.比浊度法
此法根据细菌悬液的浊度与菌数成正比的原理，将细菌悬液与标准浊度管进行比较，以推算其菌数的一种间接表示方法。
（2）水中细菌活菌数的测定
1.平板菌落计数法
根据在固体培养基上所生长的菌落计数，每一个菌落是由一个单细胞繁殖而成，为肉眼可见的细胞群体。根据菌落数可以计算出待测菌液中活菌数量。
方法：a.取水样1mL利用无菌水按10倍数作一系列稀释，水样稀释浓度要求在平板上长出的菌落数在30~300个之间为宜。稀释时应尽量使微生物细胞分散开，否则易长出片状菌苔。
b.以无菌操作用无菌移液管吸取1ml充分混匀的水样，注入无菌平皿中，再倾入约15ml已融化并冷却到45℃的营养琼脂培养基，迅速转动，使水样与培养基充分混匀。
c.置水平位置静止凝固后，倒置于37℃培养24h，每个水样取三个连续适宜稀释菌液倒平板，各倾注三个平皿，同时作不加水样的空白对照。
d.待菌落生长好取出平皿计数，统算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。根据下公式计算：
每毫升菌液中活菌总数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数
2.液体稀释法（MPN法）
此法也可进行活菌数计算，由于某些微生物在琼脂平板上不易生长，故不适用平板菌落计数，但在液体培养基中生长易于检查。因此根据某些稀释菌液接种培养后所生长微生物的试管数，用统计数学方法计算出原样品的含菌量。如反硝化细菌、氨化细菌、粪大肠杆菌及
紫色非硫光合细菌均可用此法计数。
操作时先将样品作一系列的10倍稀释，至最后一级稀释液接种后，不出现菌的生长为临界级数。取后五种稀释液接种于无菌的液体培养基中，一般需做3~5管平行实验。适温培养，根据生长菌试管数，确定数量指标，查出菌的近似值，再行计算。
3.滤膜过滤计数法
当单位体积水样中所含微生物数量较少时，可通过超滤膜过滤浓集后，再进行培养计数。
每毫升水样的含菌数=滤膜上的总菌数/浓缩水样的毫升数
（3）应用分光光度计测定细菌数量
每种菌细胞能吸收和散射通过它们的光，每种菌的散射光强度及吸收光度与细胞总数有相对应的关系。菌体越多，悬液浊度越大，散射及吸收光越多。利用分光光度计测定悬液减少光线透过的程度，用光密度（OD）表示，OD是透光率的对数函数同细胞总数成正比。光密度可用光电比色计或分光光度计测定。测定时首先用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度－菌数的标准曲线。然后测出未知菌悬液的光密度，从标准曲线中查出相应的菌数。此法比较简单而精确，但如果待测样品颜色太深或含其它悬浮物较多时，不宜使用此法。
三、土壤中：
土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
例如：稀释平板法
操作步骤
（1）土壤系列稀释液制备
取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入装有70ml水的广口瓶中，在振荡机上振荡10min。迅速吸取10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，混合均匀。如此依次配制一系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。
（2）平板制备和培养
从两个稀释倍数的土壤稀释液中吸取1.00ml，分别放入五套培养皿中；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。
（3）镜检计数
用显微镜观察，明显有菌丝的一般是真菌，丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，较细。细菌有球状和杆状，酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状芽。 在两级稀释度中，选细菌和放线菌菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。 如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。
4）计算
土壤微生物数量（cfu/g）=MD/W
式中: M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。
例如：FDA染色涂片法测定活菌丝数
操作步骤
1）土壤分散
取10.00g新鲜土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入
95 ml 0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡15 min。
（2）染色
取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中，加入4 ml 磷酸盐缓冲溶液，再加入1 ml FDA染色液。室温下培养3 min 后，加入1 ml 琼脂溶 液，混匀。
（3）涂片和镜检
取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上，盖上盖玻片，迅速用荧光显微镜进行镜检计数。
（4）计算