大孔树脂吸附操作流程及注意事项
一、〖大孔吸附树脂的说明书、规格、标准〗 .... - 2 -
二、〖大孔吸附树脂的选择〗 .................. - 3 -
三、〖大孔吸附树脂的预处理〗 ................ - 5 -
四、〖大孔吸附树脂的吸附条件和解吸附条件的选择〗- 6 -
五、〖大孔吸附树脂的吸附〗 .................. - 8 -
六、〖大孔吸附树脂的工艺验证〗 ............. - 10 -
七、〖大孔吸附树脂的再生及使用有效期〗 ..... - 11 -
八、〖大孔吸附树脂的残留测定〗 ............. - 12 -
一、〖大孔吸附树脂的说明书、规格、标准〗
大孔吸附树脂是一类新型非离子型高分子聚合物，具有选择性吸附有机化合物的能力，其吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键等完成的，被广泛应用于药学领域，如抗生素的提取分离、天然产物的分离、中药有效成分的提取分离和复方制剂中杂质的去除等。
大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体 ,加入二乙烯苯为交联剂 ,甲苯、二甲苯为致孔剂 ,它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。树脂一般为白色的球状颗粒 ,粒度为 20～60 目 ,是一类不含离子交换集团的交联聚合物 ,它的理化性质稳定 ,不溶于酸、碱及有机溶剂 ,不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力 , 通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作的 ,使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱而分开达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。
由树脂提供方制订并向应用方提供。技术要求内容包括：
1．规格标准 标准内容应包括：名称、牌(型) 号、结构(包括交联剂) 、外观、极性；粒径范围、含水量、湿密度(真密度、视密度) 、干密度(表观密度、骨架密度) 、比表面、平均孔径、孔隙率、孔容等物理参数；未聚合单体、交联剂、致孔剂等添加剂残留量限度等参数；用途及相关标准文号等。
2．使用说明书 说明书内容应包括：树脂性能简介、主要添加剂种类与名称；未聚合单体，交联体、主要添加剂是否残留及残留量控制方法与限量检查方法；树脂安全性动物试验资料，或其它能证明其安全性的试验资料；使用注意事项及可能出现异常情况的处理方法；树脂有效使用期的参考值；生产厂家及生产许可证等合法证件。
大孔树脂使用注意事项
1) 该树脂含水70%左右，湿态0℃以上保存。严防冬季将球体冻裂。
2) 该树脂物化性能稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不降解，热失重温度266℃。
3) 树脂使用前，需根据使用要求，进行程度不同的预处理, 是将树脂内孔残存的惰性溶剂浸除。树脂预处理方法是在提取器内加入高于树脂层10cm 的乙醇浸渍4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止。最后用水反复洗涤至乙醇含量小于1%或无明显乙醇气味后即可用于生产。（我厂药用树脂已经过了深程度处理，一般可直接用于生产）
4) 生产中建议树脂装填高度2米左右，吸附流速4-10米/小时(1-4BV/小时) 。解吸剂可选用乙醇、甲醇、丙酮等。
5) 树脂强化再生方法：当树脂使用一定周期后, 吸附能力降低或受污染严
重时需强化再生，其方法是在容器内加入高于树脂层10cm 的3%-5%盐酸溶液浸泡2-4小时，然后进行淋洗通柱。继用3-4倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱, 然后用净水洗至接近中性；再用3%-5%的氢氧化钠溶液浸泡4小时。最后淋洗通柱, 用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至PH 值为中性, 备用。
二、〖大孔吸附树脂的选择〗
大孔吸附树脂是一类新型的非离子型高分子吸附剂 ,树脂通常依其极性分为非极性、弱极性、极性三类 ,树脂的结构一般为苯乙烯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、丙烯酸或氧化氮类。树脂吸附性能的优劣是由其化学和物理结构决定的 ,同一型号大孔吸附树脂上的吸附能力有差异。例如对于LD605型吸附树脂对有效部位吸附能力强弱的规律为:以药材计生物碱 > 黄酮 > 酚性成分 > 无机物。不同树脂结构对不同物质的吸附效果不同。一般大孔吸附树脂吸附符合一下规律：非极性物质在极性介质（水）内被非极性吸附剂吸附, 极性物质在非极性介质中被极型吸附剂吸附 ,带强极性基团的吸附剂在非极性溶剂里能很好的吸附极性化合物。聚苯乙烯型树脂一般适用于非极性和弱极性物质的化合物如皂苷类和黄酮类; 聚丙烯酸类树脂 ,一般带有酯基或酰氨基 ,对中极性和极性化合物如黄酮甾醇和酚类的吸附较好。
筛选方法：根据被分离的有效部位不同的理化性质，选择适宜的树脂种类进行分离纯化，树脂种类的筛选可用比上柱量、比吸附量、比洗脱量等指标来衡量。目前，研究中多用静态吸附法或动态吸附法进行测定，且往往以其中一种方法得出结论的居多。事实上，静态吸附法以比表面积为主要影响因素，动态吸附法以孔径大小为主要影响因素，故很可能出现二者结论不一致的情况。李氏等在考察HA －1、HA －2型树脂对阿霉素吸附量时，就曾发现在静态吸附实验中，HA －2的吸附率略高于HA －1，而在动态吸附实验中这一次序被颠倒了过来。其原因可能是在静态吸附实验中，孔径相近时HA －2的比表面积较大，因而吸附率高。在动态吸附实验中，溶液定向流动，具有较高分子量的阿霉素分子易于进入大孔径的HA －1树脂
为进一步准确筛选出适宜的树脂种类，除考察静态、动态吸附量等指标外，还应进行静态或动态的吸附动力学研究。孟氏等在用静态法选择分离紫草宁树脂种类时作了静态吸附动力学实验，认为仅用吸附率和吸附量而不考虑吸附动力学特征来评价某一树脂的优劣是不全面的。汤氏作了HA －01、HA －02、HA －03型树脂分离牛磺酸的静态、动态动力学实验，准确地回答了树脂的选择问题，并对树脂的孔径、比表面积等作了合理的解释。另外，还应用比洗脱量或解吸率指标来衡量树脂解吸性能。在某些情况下，吸附作用力强不利于解吸，如S-8树脂吸附量大但解吸率低，不适用于分离银杏叶黄酮。
大孔吸附树脂依据其聚合的单体组成不同, 可以分成非极性和极性两大类。
依据极性大小还可以分为弱极性、中等极性和强极性。非极性吸附树脂适合从极性溶液(如水溶液) 中吸附非极性物质; 中等极性吸附树脂即可从极性溶液中吸附非极性物质, 又可以从非极性溶液中吸附极性物质; 极性吸附树脂易从极性溶液中吸附极性物质。一般非极性物质在水溶液中易被非极性树脂吸附; 极性物质在水溶液中易被极性树脂吸附。
大孔树脂在实验室用时，要选择它的粒径，一般要筛除60目以下的小颗粒，而且不用时一定要用溶剂（水或乙醇泡着）不然的话可能失效。以下是几个型号
三、〖大孔吸附树脂的预处理〗
新购树脂可能含有分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留，往往残留少量单体、致孔剂和其他有机物质, 所以使用前应按以下步骤进行预处理, 以除去杂质。
1. 装柱前清洗吸附柱与管道，并排净设备内的水，以防有害物质对树脂的污染。
2. 取市售大孔吸附树脂，用乙醇加热回流洗脱（或用改良索氏提取器加热洗脱），洗至洗脱液蒸干后无残留物。经乙醇洗净的树脂挥去溶剂后保存备用。或将树脂浸泡在乙醇、甲醇等醇类溶剂一定时间, 然后在真空条件下干燥得到处理树脂。
3. 于吸附柱内加入相当装填树脂0.5倍的水，然后将新大孔树脂投入柱中，把过量的水从柱底放出，并保持水面高于树脂层表面约20厘米，直到所有的树脂全部转移到柱中。
4. 装柱后，先用水反洗, 从树脂低部缓缓加水，逐渐增加水的流速使树脂床接近完全膨胀，保持这种反冲流速直到所有气泡排尽，所有颗粒充分扩展，小颗粒树脂冲出, 除去树脂碎片和杂物。
5. 用2倍树脂床体积（2BV ）的乙醇，以2BV/H的流速通过树脂层，并保持液面高度，浸泡过夜。
6. 用2.5-5BV95%乙醇，2BV/H的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止。
7. 从柱中放出少量的乙醇，检查树脂是否洗净，否则继续用乙醇洗柱，直至符合要求为止。检查方法：
a. 水不溶性物质的检测 取乙醇洗脱液适量，与同体积（有1∶1；1∶2；1∶5三种报道）的去离子水混合后，溶液应澄清；再在10℃放置30分钟，溶液仍应澄清
b. 不挥发物的检查 取乙醇洗脱液适量，在200-400nm 范围内扫描紫外图谱，以95%乙醇为空白对照，在250nm 左右应无明显紫外吸收
8. 用去离子水以2BV/H的流速通过树脂层，洗净乙醇。以大量的蒸馏水洗去乙醇，洗至无醇味, 备用。少量乙醇存在将会大大降低树脂的吸附力
9. 用2BV4%的HCL 溶液，以5BV/H的流速通过树脂层，并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性（pH 试纸检测pH=7）。
10. 用2.5BV 5%的NaOH 溶液，以5BV/H的流速通过树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性（pH 试纸检测pH=7）。
11. 树脂吸附达饱和的终点判定方法：药液以一定速度通过树脂柱，根据预
算用量，在其附近，取过柱液约3ml ，臵10ml 具塞试管中，密塞后猛力振摇。观察泡沫持续时间，如泡沫持续时间为15分钟以上，则为阳性，此时树脂达到饱和。
四、〖大孔吸附树脂的吸附条件和解吸附条件的选择〗
吸附条件和解吸附条件的选择直接影响着大孔吸附树脂吸附工艺的好坏 ,因而 ,在整个工艺过程中应综合考虑各种因素 ,确定最佳吸附解吸条件。
影响树脂吸附的因素很多 ,主要有被分离成分的性质(极性和分子大小等) 、上样溶剂的性质 (溶剂对成分的溶解性、盐浓度和 pH值) 、上样液浓度及吸附流速等。通常 ,极性较大分子适用中极性树脂上分离 ,极性小的分子适用非极性树脂上分离; 体积较大化合物选择较大孔径树脂 ;上样液中加入适量无机盐可以增大树脂吸附量; 酸性化合物在酸性溶液中易于吸附 ,碱性化合物在碱性液中易于吸附 ,中性化合物在中性液中吸附; 一般上样液浓度越低越利于吸附; 对于滴速的选择 ,则应保证树脂可以与上样液充分接触吸附为佳。
影响解吸条件的因素有洗脱剂的种类、浓度、pH 值、流速等。洗脱剂可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等 ,应根据不同物质在树脂上吸附力的强弱选择不同的洗脱剂和不同的
洗脱剂浓度进行洗脱 ;通过改变洗脱剂的 pH 值可使吸附物改变分子形态 ,易于洗脱下来; 洗脱流速一般控制在 0. 5～5ml/ min。
大孔吸附树脂的孔径和比表面积是影响大孔吸附树脂对中草药有效成分吸附的主要因素。大孔吸附树脂比表面积越大, 单位质量大孔吸附树脂与中草药有效成分作用的面积越大, 单位质量大孔吸附树脂吸附的有效成分量越大。同时大孔吸附树脂对有效成分作用面积受大孔吸附树脂孔径的影响。大孔吸附树脂表面积由树脂外表面积和树脂内部孔网形成的内表面积组成。当树脂孔径小于吸附的有效成分分子时, 有效成分分子不能进入树脂内部, 只能吸附在树脂外表面; 当树脂孔径大于有效成分分子时, 有效成分既可以吸附在树脂外表面也可吸附在内表面。综合孔径和比表面积作用结果, 当树脂孔径较大, 大孔吸附树脂比表面积越大, 吸附量越大。
吸附工艺对有效成分在大孔树脂上吸附效果的影响。黄酮、皂苷、生物碱等中草药有效成分加入大孔吸附树脂层析柱后, 通过范德华力或氢键等分子间作用力吸附在大孔吸附树脂上。同时黄酮、皂苷、生物碱等成分与溶液作用溶解在溶液中。黄酮、皂苷、生物碱等有效成分在大孔吸附树脂上的吸附和解吸是大孔吸附树脂吸附和溶液溶解相互作用相互竞争的结果。当分子间作用力产生的吸附作用占优时, 有效成分吸附在树脂上; 当溶液的溶解作用占优时, 有效成分从树脂上洗脱。
进柱液pH 值对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。改变溶液pH 值, 可以影响中草药有效成分在大孔吸附树脂上的吸附。溶液pH 值对有效成分在大孔
吸附树脂上吸附影响体现在以下几方面。首先, 溶液pH 值变化可以改变有效成分在溶液中存在的形式。例如, 生物碱在碱性溶液中以游离态形式存在, 而在酸性溶液中以离子形式存在。再次, 溶液pH 值改变可以影响有效成分在溶液中的溶解度。例如:溶液pH 值升高皂苷在溶液中的溶解度增大。最后, 溶液pH 值变化改变溶液极性, 影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用力。对生物碱等碱性有效成分, 将溶液变成酸性, 改变生物碱等碱性成分在溶液中的存在形式, 提高其在酸性溶液中的溶解度, 降低其在大孔吸附树脂上的吸附。宓晓黎等使用非极性大孔吸附树脂分离复方降压胶囊中的生物碱, 研究发现随溶液pH 增加, 生物碱的吸附量增加。黄酮、皂苷和其他苷类是中性或弱酸性物质, 提高溶液pH 值, 提高溶液中的溶解度同时增加有效成分与大孔吸附树脂之间分子间作用力。高红宁等研究发现苦参黄酮在AB-8上的吸附量随pH 值增加, 先增加后降低, 存在最佳pH 值对应最高的吸附量。李立等研究不同大孔吸附树脂吸附洋地黄中强心苷, 随pH 值增加, 溶液pH 在6-7时, 吸附量急剧增加;pH 值大于7时, 吸附量不变或降低。孟琴等研究pH 值对大孔吸附树脂吸附紫草宁的影响发现在酸性条件下, 吸附量大, 在碱性条件下, 吸附量小。酸性有效成分应该在酸性条件下吸附, 碱性有效成分应该在碱性条件下吸附。反之在解吸洗脱阶段, 酸性有效成分使用碱性洗脱液效果更好; 碱性有效成分使用酸性洗脱液洗脱效果更佳。
温度对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。由于黄酮、皂苷、生物碱等有效成分在大孔吸附树脂上的吸附是通过分子间作用力, 属于物理吸附。温度升高, 一方面有效成分在树脂上的吸附作用降低, 另一方面, 有效成分在溶液中的溶解度增大。综合结果温度升高有效成分在大孔吸附树脂上的吸附速度和吸附量降低。李雁群比较了在15℃和65℃下AB-8树脂对罗汉果中皂苷的吸附速度, 发现在低温下吸附速度更快。李剑君等使用AB-8树脂吸附葛根素, 绘制了15℃、30℃、50℃条件下的吸附等温度曲线, 认为温度升高葛根素吸附量减少。所以在吸附阶段, 应该降低温度; 反之, 在解吸洗脱阶段, 应该升高温度。
有效成分初始浓度对吸附的影响。黄酮、皂苷、生物碱等在大孔吸附树脂上是物理吸附, 从物理吸附等温方程可以发现, 初始浓度增加, 平衡吸附量增加, 吸附率降低, 平衡吸附时间增加。李剑君等使用AB-8树脂吸附葛根素, 研究吸附等温曲线认为葛根素初始浓度增加, 吸附率反而减少。李立等研究不同进柱液浓度对大孔吸附树脂吸附洋地黄中强心苷的影响, 发现进柱液浓度液增加, 平衡吸附时间延长, 吸附量增加, 吸附率降低。
洗脱液性质对大孔吸附树脂提取有效成分效果的影响。将中草药有效成分从大孔吸附树脂上洗脱, 是利用有效成分在洗脱液中的溶解作用大于有效成分和大孔吸附树脂间的吸附作用。使用的洗脱液应该对有效成分具有良好的溶解作用。黄酮、皂苷、生物碱以及其他苷类物质在乙醇等醇类溶液中溶解度较大。常使用乙醇作为洗脱液。乙醇溶液浓度从两方面影响有效成分在大孔吸附树脂上的吸附。一方面, 乙醇浓度不同, 乙醇溶液极性不同, 影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用力。另一方面, 乙醇浓度不同, 影响有效成分在乙醇溶液中的溶解
度。不同浓度乙醇液影响有效成分在大孔吸附树脂上的解吸作用是两种作用相互竞争的结果。田晶等使用AB-8树脂吸附大豆中大豆皂苷, 研究得到洗脱液中总皂苷含量随洗脱液乙醇浓度增加, 先增加后降低。在乙醇浓度为50%时, 洗脱液中总皂苷含量最大, 而其他的糖类和蛋白较少。
盐效应 中药有效成分受盐效应的影响，在提取溶液中被纯化成分的溶解度下降，有利于树脂吸附，使吸附量增加。盐效应因盐的种类与用量的不同而有所不同。侯氏等在作盐溶液对吸附纯化效果考察时，发现不同浓度的氯化钠、高浓度的氯化钾可以提高指标成分的比上柱量，低浓度的氯化钾则会降低其比上柱量；曾氏等在绞股蓝总皂苷提取工艺的研究中对加盐（氯化钠）的浓度作了考察，认为氯化钠浓度越高，树脂对总皂苷的吸附能力越强。张氏在作氯化钠对紫苏色素在S-8大孔吸附树脂纯化效果研究中认为，氯化钠对紫苏色素在S-8大孔吸附树脂上的吸附有明显的促进作用，但是，这种作用并不是与氯化钠的浓度呈完全的线性关系。汤氏等在对牛磺酸在大孔吸附树脂上的吸附－解吸行为研究中认为，盐效应对牛磺酸在S-8和D4020树脂上的吸附行为影响不大。
五、〖大孔吸附树脂的吸附〗
1. 吸附洗脱特性参数的测定
比上柱量（Saturation ratio ，S ）：达到吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成份的总和，S=（M 上－M 残）/M，表示树脂吸附承接的总体能力 ，S 越大，承接能力越强。是确定树脂用量的关键参数。
比吸附量（Adsorption ratio ，A ）：单位质量干树脂吸附成份的总和，A=（M 上－M 残－M 水洗）/M，表示树脂真实吸附能力，A 越大吸附能力越强，是选择树脂总类与评价树脂再生效果的重要参数。
比洗脱量（Eluation ratio，E ）：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，E=M洗脱/M，表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力。E 越大表示洗脱溶液剂的洗脱能力与树脂的解吸附能力越强，是选择树脂及洗脱溶剂的重要参数。其中M 为干树脂质量，M 上是上柱液中指标成分的质量，M 残是过柱流出液中指标成分的质量，M 水洗为水洗液中指标成分的质量，M 洗脱为洗脱溶剂中的指标成分的质量。
侯氏等在对大孔吸附树脂纯化中药有效成分影响因素考察时，提出了反映药物在吸附前、吸附后、解吸附后全过程的3个概念：比上柱量、比吸附量、比洗脱量。3个参数均以单位质量干树脂计，提高了评价指标的准确性与科学性，便于估算树脂用量，利于工业化生产。 比上柱量：达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和，表示树脂吸附、承载的总体能力，4 越大则承载能力越强，是确定树脂用量的关键参数。
比吸附量：单位质量干树脂吸附成分的总和，表示树脂的真实吸附能力，. 越大则吸附能力越强，是选择树脂种类与评价树脂再生效果的重要参数。
比洗脱量：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，
表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力，比洗脱量越大表示洗脱溶剂的洗脱能力与树脂的解吸附能力越强，是选择洗脱溶剂的重要参数。
此外，还常用到以下2个指标评价树脂的吸附与解吸附能力。吸附率：吸附前后样品溶液浓度之差占上柱前样品溶液浓度的百分率；解吸率：洗脱剂中样品的量相对于树脂吸附量的百分率。
2. 树脂型号、树脂用量和洗脱剂的确定
将红花按提取所得之提取液合并（药材羟基红花黄素A 含量6.25%），测得其中羟基红花黄素A 含量为 7.628 mg〃mL -1。
取HPD100、CAD40、HPD 600及860021型树脂，用红花提取液上柱，先用水洗，再用不同浓度的乙醇洗脱，分别收集过柱残液、水洗液、乙醇洗脱液，分别测定其中羟基红花黄素A 含量，并计算有关的特性参数，结果见表3-6。
表3-6 不同型号树脂吸附纯化特性参数
Saturation ratio
Resin model
HPD 600
CAD 40
HPD 100
860021 Material （g/g） 0.215 0.072 0.110 0.298 HSY-A （mg/g） 13.45 4.50 6.86 18.65 Adsorption ratio HSY-A(mg/g) 11.08 1.80 1.82 15.82 Eluation ratio HSY-A(mg/g) 11.50 1.39 2.18 2.29
由表3-6结果可知，以羟基红花黄素A 为指标成分，红花提取液在不同树脂上具有不同的吸附、洗脱效果，其中CAD 40 和HPD 100型树脂比上柱量较小； HPD 600和860021型号树脂的比上柱量及比吸附量均较大，但是860021用30%乙醇洗脱时的比洗脱量小, 即样品损失严重，HPD 600型树脂的比上柱量较大且比洗脱量大，吸附洗脱性能很好。综合比较，决定选用比吸附量较大、比洗脱量也大的HPD 600型树脂，同时确定洗脱液为30%乙醇。
根据所测得HPD 600型树脂的比上柱量，折算每L 湿树脂可承载约0.2 kg红花药材的提取液，考虑到红花药材羟基红花黄素A 含量高，并且兼顾生产工艺和药材含量的变化，决定上样量用每L 湿树脂承载0.1 kg红花药材的提取液。
3. 水洗量的确定
用不同柱体积的水洗脱上样的HPD 600大孔树脂柱，同时测定水洗液中羟基红花黄素A 含量及观察颜色，结果见表3-7。
表3-7 水洗量的确定实验结果
Vol. of water （vol. of 1 2
clomn ）
Weight of eluent（mg ） 145.3 22
-1Content of HSY-A（mg ·mL ） 1.75 11.91
Color of eluent Deep brown Yellow 3-4 18 19.0 Yellow 5-6 16 19.1 Yellow
根据实验结果，1倍柱体积水洗柱即可将大部分的杂质除去，进一步洗脱将损失有效成分羟基红花黄素A 。为此，本工艺采用1倍柱体积水洗柱除杂质。
4. 洗脱剂用量的确定
取上述达到饱和并经水洗的树脂柱，用30%乙醇洗脱，分段收集，测定其中红花黄素A 的含量，计算比洗脱量及洗脱率，其结果见表3-8。
洗脱率 = 洗脱液中HSY-A 的含量（mg ）
被吸附于树脂上HSY-A 的量（mg ） colemn vol.
（times ）
No.1-2
No.3-4 × 100% eluent （mL ） 40 40 HSY-A HSY-A （mg ） ratio -1（mg ·mL ） （%） 0.831 33.24 79.2 0.094 3.76 9.0
由上述结果可知，用相当于4个柱体积的30%乙醇洗脱时，指标成分羟基红花黄素A 的洗脱转移率近88.2 %，几乎全部从柱上解吸下来。而且，第3-4体积洗脱液中羟基红花黄素A 含量明显下降（仅为第1－2体积的10%左右），考虑到工业化生产效率，因此，洗脱剂的用量确定为4个柱体积。
5. 吸附泄漏点的检查
取洗脱液10 mL 减压浓缩至1 mL 左右，滴1滴在滤纸上，呈现鲜黄色斑点，紫外灯（365nm ）下显亮黄色荧光，氨气薰后，斑点转为橙黄色，紫外灯（365nm ）下显亮橙色荧光；另取浓缩样品滴1滴在滤纸上，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，显现橙黄色斑点，紫外灯（365nm ）下显亮橙色荧光。即为样品在树脂上超载。
6. 吸附及洗脱流速的确定
分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml/cm3/min 的流速上样并检查泄漏，发现当流速4.0 ml/cm3/min，有可能产生吸附不好而出现泄漏现象，为保吸附完全，兼顾效率，故确定上样流速为1.0-2.0 ml/cm3/min之间。继分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml/cm3/min 的流速洗脱，发现以4.0 ml/cm3/min 的流速洗脱4个保留体积后，洗脱液中仍然可以检出羟基红花黄素A ，而低于3.0 ml/cm3/min 的流速几乎检不出羟基红花黄素A ，因此确定洗脱流速为1.0-2.0 ml/cm3/min之间。
六、〖大孔吸附树脂的工艺验证〗
根据以上大孔吸附树脂吸附洗脱性能研究的结果，确定红花黄素制备工艺中大孔吸附树脂吸附、纯化的最佳工艺条件为：选用HPD 600型树脂，树脂用量为0.1 kg药材∶1L 湿树脂，先用1个柱体积水冲洗，弃去水洗液，再用4个柱体积的30%乙醇洗脱，收集醇洗脱液。
流速的控制为：吸附：每分钟，每立方厘米树脂0.033～0.268ml 或每小时2-16个柱体积；洗脱：洗脱流速一般都比吸附时慢一倍以上，为每小时1-4个柱体积。
按上述大孔吸附树脂吸附、纯化最佳工艺条件，用3批红花提取液验证大孔
吸附树脂吸附、纯化工艺条件，结果见表3-9。
从结果可以看出，三批红花提取液中的羟基红花黄素A 的洗脱率基本一致，说明该大孔吸附树脂吸附、纯化工艺中的树脂用量、洗脱剂的选择及用量等条件较为合理，工艺较为稳定。
表3-9 红花大孔吸附树脂吸附、纯化最佳工艺条件的验证
Experimental number
Item
Content of HSY-A in medicinal materials（%） Feedstock of medicinal materials（g ） Vol. of extrn. liquid（L ）
-1
Content of HSY-A in extrn. liquid（mg ·mL ） Quant. of macro-porous adsorbent （L ） Vol. of 30%ethanol eluent（L ）
-1
Content of HSY-A in 30%ethanol eluent （mg ·mL ） Quant. of HSY-A in 30%ethanol eluent（g ） Availability of HSY-A（%）
1 6.25 200 4.0 3.04 2.0 8.0 1.204 10.43 85.8
2 6.25 200 4.0 2.93 2.0 8.0 1.211 9.93 84.8
3 6.25 200 4.0 2.91 2.0 8.0 1.160 9.28 79.9
七、〖大孔吸附树脂的再生及使用有效期〗
树脂柱经反复使用后 , 树脂表面及内部残留许多非吸附性成分或杂质使柱颜色变深 , 柱效降低 , 因而需要再生 , 一般用 95 %乙醇洗至无色后用大量水洗去醇即可。如树脂颜色变深可用稀酸或稀碱洗脱后水洗，用0.01%--1mol/L NaOH(或HCl) 洗涤或浸泡适当时间，至树脂接近原颜色为宜，继而用蒸馏水洗至中性即可再用。如柱上方有悬浮物可用水 , 醇从柱下进行反洗可将悬浮物洗出 , 经多次使用有时柱床挤压过紧或树脂颗粒破碎影响流速 , 可从柱中取出树脂 , 盛于一较大容器中用水漂洗除去小颗粒或悬浮物再重新装柱使用。大孔吸附树脂应湿态保存，若部分颗粒暴露在空气中失水，在进行水溶性杂质分离时，失水后被空气填充的颗粒会浮于水面，此时将上浮树脂用乙醇处理，将树脂内部的空气排出后使用。
树脂的再生：一般用4个柱体积的95%乙醇洗涤，然后再用约4个柱体积的水冲洗至无醇味，即可。当树脂使用了若干个周期时，其吸附性能有所下降，此时先用2个柱体积的3-5%NaOH溶液过柱，然后用2个柱体积95%乙醇洗涤，再水洗至中性，树脂的吸附性能即能恢复。
有效期：该树脂性能稳定，一般使用有效期为2-3年。有效期使用主要由实际应用工艺确定，直至提取效率低于工艺要求为准。本工艺试验了使用50个周期的树脂，吸附性能未见明显下降，暂定使用周期为50个。并根据考察50个使用周期后的大孔树脂对羟基红花黄素A 的比吸附量为9.1 mg/g，因而确定再生和使用周期的标准为：羟基红花黄素A 比吸附量小于8 mg/g，即停止使用。
八、〖大孔吸附树脂的残留测定〗
国家药品监督管理局规定必须对大孔树脂残留物进行检测，含烷烃类不得超过0.002％，苯不得超过0.0002％，甲苯不得超过0.002％，对二甲苯不得超过0.002％，邻二甲苯不得超过0.002％，甲苯不得超过0.002％。一般采用顶空气相色谱法对其系列残留物进行检测。
色谱条件 色谱柱聚二甲基硅氧烷(ＳＰＢ-1) 毛细管柱(ＳＵＰＥＬＣＯ)0.32ｍｍ×60ｍ,0.25μｍ。柱温程序升温。丹参总酚酸、地黄低聚糖50～150℃,50℃保持3ｍｉｎ后, 以每分钟升温5℃的速度升至150℃, 保持2ｍｉｎ; 贯叶连翘提取物50～160℃,45℃保持7ｍｉｎ后每分钟升温5℃,160℃保持1ｍｉｎ。检测器温度250℃; 进样口温度200℃。分流比为10∶1, 柱流速1.0ｍＬ〃ｍｉｎ-1。顶空取样瓶在85℃预平衡20ｍｉｎ。
对照品溶液的制备 测定丹参总酚酸、地黄低聚糖用精密称取苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷、甲基环己烷各适量, 加水制成每1ｍＬ中含苯0.67μｇ, 甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷、甲基环己烷各6.7μｇ的混合溶液, 即得。
测定贯叶连翘提取物用精密称取苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷、甲基环己烷各适量, 分别加50%甲醇制成每1ｍＬ中含苯0.4μｇ, 甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷、甲基环己烷各4.0μｇ的混合溶液, 即得。
供试品溶液的制备 取丹参总酚酸、地黄低聚糖各1ｇ, 精密称定, 分别臵容积为10ｍＬ的顶空取样瓶中, 各精密加入水3ｍＬ, 加盖密封, 振摇使溶解, 摇匀, 即得。另取贯叶连翘提取物1ｇ, 精密称定, 臵容积为10ｍＬ的顶空取样瓶中, 精密加入50%甲醇5ｍＬ, 加盖密封, 振摇并超声处理10ｍｉｎ使溶解, 摇匀, 即得。
讨论 1. 《中国药典》2000年版二部附录有机溶剂残留量测定法项下测定法有溶液直接进样法和顶空进样法两种, 本研究中由于各大孔吸附树脂残留溶剂允许限度较低, 供试品溶液浓度较浓, 气相色谱法直接进样, 大量不挥发性成分残留在色谱柱中, 容易堵塞色谱柱, 采用顶空进样,
可以消除对色谱柱的损坏和
污染。
2. 为使样品中树脂残留物能较好的提取溶解, 所选提取溶剂应能使供试品完全溶解。上述对照品中, 部分在水中及50%甲醇溶液中不易溶解, 制备对照品溶液时, 可先加微量二甲基甲酰胺溶解, 再配成水溶液或50%甲醇溶液。
3. 由于大孔吸附树脂残留溶剂允许限度较低, 顶空进样法是以顶空气进样, 对照品溶液浓度极低, 故测定精密度时ＲＳＤ偏高, 但均符合《中国药典》2000年版有机溶剂残留测定法项下ＲＳＤ不大于10%的要求。
4. ＩＣＨ(药品注册的国际技术要求) 规定溶剂残留限度苯为不得过0.0002%,甲苯0.089%,二甲苯0.217%,正己烷0.029%,甲基环己烷0.118%,苯乙烯, 二乙烯苯未明确, 本研究的限量检查是参照国家食品药品监督管理局药品审评中心的一般要求进行的, 其限度为每1ｇ样品含苯不得过2μｇ, 含甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷、甲基环己烷均不得过20μｇ。