烷基多糖苷APG 平均聚合度的测定和预测
摘要：烷基多糖苷是由葡萄糖和脂肪醇通过Fischer 反应制得的。与自由的葡萄糖分子和脂肪醇反应产生APG 相比, 在相同的条件下, 产生的单葡萄糖苷分子可以使生成APG 的反应进一步地进行。目前, 对APG 平均聚合度PD 的测定还没有简单且适用的方法。文中建议使用气相层析的方法来测定APG 的PD 值。可以使用Flory 聚合模型来计算PD 值, 但这需要对单葡萄糖苷和未反应的脂肪醇的摩尔分数进行实验性的评价。对于反应而言, 葡萄糖分子中真正具有的活性中心的个数是一个关键的参数, 要通过对文献数据进行充分地分析后才能得到这个参数值。实验结果表明, 葡萄糖分子是一个具有双重功能作用的分子。动力学模拟实验支持了上述的说法。
关键词：APG; 气体层析; 聚合; 动力学; 计算机模拟
1. 前言
烷基多糖苷（APG ）是由可再生的原料葡萄糖和脂肪醇通过Fischer 反应精制而成的，具有表面张力活性的混合物，其得到工业化规模的生产还不到二十年，但是在‘Fischer 糖基化’中，它们的酸起催化作用在一个世纪以前就被发现了。葡萄糖与过量的醇主要生成单葡萄糖苷, 并拌有少量的双聚、三聚甚至更高聚的葡萄糖苷生成。最终生成物的构成是由多种反应竞争的结果决定的（图1）。第一步是糖的质子化过程，使葡萄糖分子在缩水过后形成离子的形式[2]。然后，它与脂肪醇反应产生烷基葡萄糖苷。活化了的糖也能与生成的葡萄糖苷分子反应形成低聚葡萄糖苷。葡萄糖低聚物能够被激化，从而能与脂肪醇或其它的低聚物反应；与后者的反应可能是烷基化反应，也有可能不是这种情况。最终生成的混合物的构成是非常复杂的，因为每一个葡萄糖苷可以以四种相互可变的形式存在（两种半乳呋喃糖苷与两种半乳吡喃糖苷）。加之，在低聚的葡萄糖中，连在一起的两个糖单元可以有不同的结合方式[3]。一个双聚的葡萄糖苷大约有30种的存在形式，而对于一个三聚和四聚的葡萄糖苷而言，分别有上百种和上千种的存在形式。产物的分布情况可以用平均聚合度PD 来描述，PD 的定义就是来自于各种低聚物的摩尔分数Ni ，其中i 表示低聚物的种类以及每个葡萄糖苷分子中包含的葡萄糖单元的个数。
图1.Fischer 糖基化之间的竞争反应
∞
PD=N1×1+N2×2+N3×3+…∑Ni ⨯i （1）
i =1
只有通过高温气相层析（HTGC ）技术才能够对烷基葡萄糖单苷和低聚烷基
葡萄糖苷混合物进行全面地分析[4]。HTGC 技术可以应用于从低聚烷基葡萄糖苷一直到十七烷基葡萄糖苷的分析。然而，由于生成物在反应中都呈现出了种类多且单种类生成量少的特点以及缺乏必要的校准物质，限制了HTGC 技术在实际中的应用。一个标准物质必须是仅仅包含属于一个单一的低聚物具有的官能团这样的物质，因此很难得到这些标准物。也存在其它测定PD 的方法，它们主要是通过对羟基官能团的数量以及对分子质量的测定而获得的[5]。这些间接的测定方法对样品的纯度要求非常高，并且样品纯度的精确性仍然不能证实。在这里，我们报道了一种可靠、实用的测定APG 平均聚合度PD 的方法。
2实验部分
2.1 原料
GPC 岛津GC-14B ，体积12QC5/B 1.10：内部直径 0.53mm ，厚度 1µm ，长度12m ，载气：氦气，检测器：FID
2.2烷基单葡萄糖苷和醇的分析测定
2.2.1 样品的制备
用10ml 吡啶把产物（200mg ），1﹣二十二醇（130mg ）和D （－）﹣甘露
糖醇（50mg ）溶解在一个50ml 的长颈瓶中。再加入3ml 六甲基二硅氮烷和2ml 三甲基氯硅烷。在室温下放置10 分钟，然后在50℃下减压蒸发出吡啶。把剩余的残余物溶解在8ml 的三丁基-甲基乙醚中，然后过滤。最后得到的溶液供分析测定用。
2.2.2 方案
注射液：0.5µl ，带有温度程序控制器的烤箱：150℃（5min ），150-300℃（4℃/min），300℃（15min ），注射器：300℃340℃。分析产品的保留时间列于表1中。
表1. 烷基单糖苷和脂肪醇的保留时间 表2. 脂肪醇的保留时间 (在?APG 的提取之后)
2.3羟基和烷基多糖苷的分析
2.3.1羟基
用30ml 二甲基醚和5ml 硫酸溶液（20%，w/w）把3g 的APG 和1g 十七醇溶解在一个250ml 的长颈瓶中。溶液在110℃下，回流加热6小时，然后冷却到50℃ 。把回流得到的溶液倒在一个500ml 的分液漏斗中，再向分液漏斗中加入30ml 二乙醚和25ml 水。把得到的混合物进行充分地摇荡，然后静置分层。保留得到的有机层溶液，用25ml 的二乙醚把溶剂层溶液提取三次；最后把4次得到的有机溶液混合在一起，再经过干燥，最终得到的溶液供分析测定用。
2.3.2实验方案
注射液：2µl ，带有温度程序控制器的烤箱：100℃（1min ），100-150℃（10℃/min），150℃（1min ），150-300℃（20℃/min），300℃（15min ），注射器：300℃，检测器：340℃。分析产品的保留时间列于表2. 中
3. 低聚物分布情况的数学描述
1952年Flory 用数学模型描述了i-聚合物摩尔分率分布的情况[7]。他首次把数学模型应用到从多功能的单体合成聚合物上来。这种类型的单体分子带有一个A 种类的单官能团和一、两个或更多几个B 种类的官能团。缩合反应仅限于A 和B 官能团之间的反应。在这里，Flory 引入了不发生分子内缩合反应的假设。而且，对于一个给定种类的官能团，在反应的任何阶段都假设它具有相同的反应活性。在这些假设条件下，给出了平均聚合度的计算公式如下：
PD=1
1-a (f -1) （2）
这里，α是指缩合了的B 官能团所占的分数，ƒ是指在单体分子中官能团（A 和
B ）的个数。另外一个重要的公式给出了包含x 个单体单元的低聚物所占的摩尔分数N x
N x =（fx-x ）
摩尔分数N x 的特值N1可以表示为：
f-1 N 1=（1-a ） （4）
这样a 写成了N 1的函数，并把它代到等式（2）中可得：
1-f a=1-N1 （5）
PD=﹝1-（f-1）（1- N11-f ）﹞-1 （6）
在N 1和f 已知的情况下，可以通过等式（6）计算PD 的值。N 1需要通过大量的测量数据才能获得，f 是针对一定的研究条件下，化学反应系统的特征参数。
4. 应用于烷基糖苷低聚物
参考文献[9]中提到了用Flory 模型来测定APG 的PD 值，但是没有清楚地描述这个过程。需要解决的主要问题是，如何在现有的合成APG 的条件下来测定葡萄糖的功能性参数f 的值。很显然，就Fischer 糖基化反应来说，在葡萄糖分子中，并不是所有端基异构的羟基官能团都具有相同的反应活性。通过对烷基葡萄糖苷混合物13C-NMR 的研究可以看到，有一半的葡萄糖单元是通过1-4糖苷键相连的，其余的一半是通过1-6糖苷键相连的。只有少量的通过1-2和1-3糖苷键相连的烷基葡萄糖苷能被检测出来。第一个可能的推断是：在糖基化过程中，葡萄糖起着一个三功能性分子（f=3）的作用；非端基异构的羟基官能团在Fischer 模型中是以A 种类官能团形式存在的，羟基官能团在位置4和6时就成B 种类形式。这个假设表明，在这些低聚物中存在着分支结构。由此，等式（6）就成了：
PD=1/（2N 1-1） （7） 1/2
假设B 种类官能团所在的位置都具有相同的活性是不实际的。这样就会出现一个极端的情况：在葡萄糖的4（或6）位置的反应将会完全抑制在葡萄糖6（或4）位置的反应。在这种情况下，葡萄糖分子表现出了具有两种截然不同功能的分子（f=2）的性质，这里非端基异构的羟基官能团成了A 种类的形式，在位置4（或6）的羟基官能团成了B 种类的形式。在这些假设下，形成的低聚物都是线形分子。把f=2代入（6）式中可以得到下面一个简单的等式：
PD=1/N1 （8）
表3. 从发表的数据得到的理论和计算PD 值的比较
由于Flory 模型没有考虑到这个参数非整数值的情况，因此对这两个可能的整数f 值进行评价选择是必要的。这个参数的测定是依据已经发表的从N 1到N 10的实验数据得来的。它们可以通过等式（1）来计算‘真实’的PD 值，并且也可以通过等式（7）或（8）来计算Flory 模型的PD 值。文献数据和计算结果列于表3中。对通过由Flory 计算出的PD 值和真实的PD 值之间的平均误差而言，由f=2得到的PD 值要比f=3得到的PD 值的平均误差要小，但是需要通过分析误差—PD 之间依附的关系曲线才能得到更多的信息。高含量的烷基单糖苷是与低的PD 值联系在一起的，这时由f=2和f=3得到的两个等式计算出的PD 值和真实值都很吻合。当烷基单糖苷的含量降低的时候，在f=2时，真实的PD 值和Flory PD 值之间的误差仍然较小，但是对于f=3的情况，误差却大大地增加了。这种现象支持了葡萄糖分子是具有双功能反应活性分子的假设。
现在假设f=2，一种未知APG 混合物的PD 值可以通过（8）式来计算： PD=1/N1=（APG 的mol 分数）/（烷基单糖苷的mol 数 ） （9）
利用这个等式计算PD 值需要两种分析测定的结果。烷基单糖苷的摩尔数可以通过气相层析的方法很容易地测定。依据化学反应中精确的物料平衡来测定APG 的摩尔数是必要的。Fischer 反应一向以产生侧链的反应而著称
[2，10]仅限于包含糖 的分子。相反，脂肪醇链被保护了起来。由于消耗的脂肪醇是按照一定的化学计量比给定的，因此，通过气相层析法对反应产物的含醇量进行测定得到的APG 总摩尔数，与反应前有大量的醇存在时得到的情况有所不同。这样，在一个单一的注射孔中就可以对两种气相层析的结果进行分析，使之评价一种APG 混合物的PD 值就成了一种可能。
5. 计算机模拟
由于存在着脂肪醇的糖基化反应与聚合反应之间的竞争，APG 合成反应的机理与Flory 所理解的情况有一点区别。特别地对于我们的应用来说，对Flory 模型进行确认是必要的。然而，有人会认为根据Folry 关于f 的定义得到的f=2的值的条件和目前所认为的不太一样。的确，葡萄糖分子表现为一
个三功能性的单体，在它上面一个B 位置发生的反应将完全抑制在其它B 处的反应。结果得到的低聚物是由？没有分支的分子组成的，而真正的f=2的情况是与直的没有分支的分子联系在一起的。为了验证我们所采用的方法的有效性，建立的化学反应动力学模型如下：
·对于每种反应物来说糖基化是一个带有部分反应次序的、不可逆的、具有双功能性质的反应。
·对反应而言，一个非端基异构的羟基官能团（位置A ）拥有一个固定的速率常数，它不会受到产生它的分子性质的影响。
·葡萄糖被认为是一个具有三功能性质的分子，
·为了解决问题定义以下5个速率常数：
1.k 0定义为 A 和脂肪醇反应的速率常数
2.k 1定义为A 与第一类的一个B 官能团的反应（葡萄糖中的位置6）速率常数
3.k 2，象k 1一样，但属于第二类的B 官能团（葡萄糖中的位置4）
4.k 12，象k 1一样，但它是等其它的B 官能团已经反应过后，A 再和脂肪醇反应得到的值（假如f=2为0）
5.k 21，象k 2一样，但它是由其它的B 官能团已经反应过后得到的值（假如f=2为0）
·计算仅仅被限于单体单元的最大数量为m 的聚合物。mol 分数Nm 一定比计算PD 值时所要求的精确度低的多。
主要模拟的参数量是m ，5个速率常数值，以及葡萄糖和脂肪醇的起始浓度。其它的参数控制着动力学平衡的内部机能。对于一个模拟要求：
·列举出所有可能产生出的化学分子的种类。（一直到m-mers ）。针对这种情况精心编写一个关于APG 分子计算机译码。
·列举出所有的能够潜在产生每种分子的基本化学反应式。
·对每个基本反应的速率常数的进行判别。
利用四级R-K 方程，来解答由反应物的起始浓度得到的相应的微分方程式。当Ni 值小于一个任意给定的小数值时， 模拟将终止
·根据等式（1）来计算最终的PD 值
·通过等式（7）和（8），由N 1来计算理论的PD 值
表4.
利用定义和Flory 模型（f=2得到的Eq. （7）和f=3得到的Eq.(8)）得到PD 值（Eq. （1））的比较。利用计算机模拟得到的摩尔比Ni 。
用C 语言编写相应的计算机程序。它需要编辑用的标准库数据，这可以从作者那得到。解答微分方程式所用的数据可以从数据处方库中调入。在所有的模拟中，参数都是任意给定的。葡萄糖的起始浓度被定在1.0，醇糖基化的比率常数k0为2.0。过量醇浓度的范围在1.2到2.0之间。对f=2和f=3 的情况，分别认为k1=k2=1,k12=k21=0,和k1=k2=k12=k21=1。在这些比率常数中选择一个共同的参数，使它对脂肪醇反应活性的影响要比在葡萄糖的4和6位置反应活性的影响要大。通过表4中的结果可以清楚校验等式（7）和（8）的有效性。这些计算支持了Flory 模型的说法，它对计算APG I-mer 的总数和测定N1以及允许通过f 真实地测定PD 值提供了正确的描述。其它的计算数据（在这里没有给出）已经证实了在两个通过k1=k2=k,k12=k21=0（弯链聚合物）和k1=2k2,k2=k12=k21=0（直链聚合物）定义的系统中，Ni 开方值都是一致的。这是因为当k1=k2的时，两个B 组基团存在对称性的原因。
6. 总结
在计算机模拟的帮助下，我们研究了Flory 模型是怎样对由葡萄糖和脂肪醇的酸催化反应制取的APG 的重新分配进行充分描述的。这个反应中，葡萄糖起着一个双功能分子的作用。这是从葡萄糖分子存在双功能和三功能这两个实际的假设中得到的。后者的理论被推翻了，这是因为它不符合Flory 模型所的在PD 和烷基单糖苷的mol 分率N 1之间的一个特定的关系。这个结果可以通过分析文献数据得到，在文献数据中可以得到不同种类的I-mers 的mol 分率的分配情况。从Flory 模型和葡萄糖作为双功能分子的角度来看，可以简单地把判断表示为N1的倒数。利用这个结果来计算APG 的样品的PD 值，要求测量烷基单糖苷和烷基多糖苷的mol 数，这两个都需要通过GC 技术来获得。
感谢
感谢de la Marne（法国）的资金支持和K.Ple 在文章语言上给予的建议。 参考文献（略）