磁性纳米材料在肿瘤检测中的应用
摘 要：因其在科学研究与临床应用，特别是生物医药方面潜在的重要应用前景，纳米科技已发展成为一个新兴的多学科交叉领域，吸引了人们更多的研究兴趣。目前，基于磁性纳米颗粒的癌症检测、诊断和治疗方案受到包括医生在内的科研工作者的极大关注，他们希望通过对磁性纳米颗粒搭载抗体/抗原、药物或基因等的研究以期能够实现在癌症诊断治疗方面的突破。由于与癌症治疗的特殊相关性，基于铁氧体纳米颗粒的治疗方案已经成为传统化疗、辐射疗法或者手术治疗的重要选择。铁氧体纳米颗粒一般由三种主要成分构成：含铁的核，聚合物涂层和功能部分。这种具有生物降解功能的颗粒可被设计制备成具有超顺磁性的纳米粒子，这更有利于其在生物检测治疗方面的应用。另外，通过在其表面连接不同功能基团的配体，可在很大程度上扩大其检测诊断的范围。
关键词：超顺磁性纳米颗粒；肿瘤；生物学特征；肿瘤检测；诊断 1
应肿瘤细胞的临床多样性，进而更难以对成功治疗提供较为准确的预测。市场上已有的抗癌药物或试剂在进入体内后难以识别正常细胞和肿瘤细胞，从而导致严重的系统毒性和副作用。而且，肿瘤的诊断和治疗通常都是滞后的，此时的癌变细胞已经入侵或转移到身体的其它部位。例如，在临床上，超过60%的患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌或子宫癌的患者都有不同程度的病灶转移。[1]由于上述诸种难题未能一一克服，癌症治疗的有效性受到了极大的限制。
当前对于肿瘤检测诊断的一些较为常用的手段，如X射线、超声、PET-CT、核磁共振成像等影像方法在肿瘤诊断方面的作用是值得肯定的，但其自身的准确
引 言
人类肿瘤是由于自身基因的不稳定
以及蛋白质特异性表达的积累而产生的一种复杂的疾病，[1]目前已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。人们普遍认为癌症为不治之症，这主要源于其治愈率低、死亡率高并具有广泛的分布性。在经济发达国家，癌症已成为使人致死的最主要原因；在发展中国家，癌症的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。调查数据显示，2008年，全世界的癌症患者约有1270万人，其中死亡人数高达760万。世界卫生组织专家预测，癌症将成为人类生命的头号杀手。
[3]
[2]
目前对于癌症的诊断和预后并不能反
度等问题仍使其在临床应用上存在局限性，有时甚至与病理诊断结果存在出入。并且如核磁共振这一类检测对于一般家庭而言，多次检测所需的费用是无法承受的，这也就导致了在肿瘤检测时间上的延误；一些有一定放射性的检测方法，如X射线、CT、PET或其组合，也不适于频繁检测。相比而言，肿瘤早期检测希望实现具有对正常人群及疑似患病人群初步诊断并允许频繁检测的目标，而上述方法均不适合作为广泛人群肿瘤早期检测。
在肿瘤学方面，目前存在的问题以及尚未满足的需求主要以下几个方面：（a）用于肿瘤成像和早期检测的先进技术，（b）可实现更精确诊断和预后的新方法，（c）可克服化疗药物毒副作用的更优化的治疗方案，以及（d）在肿瘤生物学方面寻求新的发现以用于治疗更具侵略性和致命的诸如骨转移等肿瘤表现型的方法。[1]在这些方面的发展将对实现肿瘤的个性化治疗，如肿瘤检测、诊断和治疗等，奠定坚实的基础。
超顺磁性铁氧体纳米颗粒是一类适用于生物医学应用的生物医学材料。这一类纳米颗粒的粒径在10nm~100nm，且具有生物降解性和生物相容性，可在临床前及临床环境下得到广泛应用。[4]目前市面上已存在数种铁氧体基材料，其主要用于MRI造影剂或者铁补充剂，而应用于生物检测或免疫检测的铁氧体纳米颗粒目前尚处于研究阶段。[5]
应用于生物医学领域的超顺磁性纳米颗粒一般由三部分构成：含铁的核，聚合物涂层和功能部分。具有超顺磁性的含铁的核能够使其在MRI中作为T2造影剂，另外，核的超顺磁性还能够实现靶向
或定向分离作用，这在很多方面诸如热疗、物质分离等具有较为广泛的应用。核上覆盖的一层聚合物涂层最主要的作用是防止纳米颗粒在保存过程中的团聚以及在后续合成过程中的氧化。同时，不同种类的聚合物涂层可以通过提供不同的官能基团来实现对纳米粒子的多种不同的修饰，从而可以通过在其上连接特定的抗原/抗体等生物标记物来实现对靶向细胞或组织的识别，这一作用大大拓宽了纳米粒子在生物医学领域的应用。
因此，基于以上种种，利用纳米技术发展低成本，易操作、便携式、低损伤、高准确性和快速的肿瘤早期检测方法成为当前肿瘤早期检测所急需解决的问题。
[6]
2 肿瘤细胞
2.1 生物学特点
图1 肿瘤细胞新的标记物和激发的性能[7]
Fig. 1 Emerging Hallmarks and Enabling
Characteristics
正常的细胞经过程序性的调控，最终会走向凋亡，而肿瘤细胞由于基因的改变，生长不受限制，能跳过凋亡阶段，不断或许营养，不断增殖和代谢。人类肿瘤细胞在发展的各个阶段表现出不同于正
常细胞的生物学特征，这些特征主要保障和完成肿瘤的无限增殖功能和侵袭转移至其他身体不为的能力。其中最突出的便是肿瘤细胞中基因组的不稳定性，它能够导致包括染色体重排在内的各种随机变异，以及产生某些可以适应标记物性能的基因转变。另一个具有激活特性的特征则包含由细胞免疫引起的癌变前期的炎症反应和器官组织损伤，其中一些将通过各种方式引发肿瘤发生。
另外，有研究者提出引发肿瘤细胞的截然不同的原因，这在肿瘤发展中具有重要的功能性意义，且因此可进入核心标记物之列。其中两种处于互相竞争的境地。第一种包含有细胞能量代谢程序的改编以替代控制大多数正常组织的代谢程序和对相关细胞的能量供应从而实现对肿瘤细胞连续性生长增殖的支持。另外一种则包含肿瘤细胞对来自免疫细胞的攻击和清除的主动规避，该性能特别突出了免疫系统在对抗和增强肿瘤发展和增殖过程中的两面性。上述性能均可被看作新的肿瘤标记物。
如上所述，在肿瘤诊断治疗和细胞生物学领域，我们可以得到诸多可用于肿瘤诊断检测的基于肿瘤细胞自身物质或能量代谢与正常组织或细胞代谢不同的表现型，这些特异的表现型可用作肿瘤检测诊断过程中的生物标记物。引起这些物质或能量代谢产生变化的细胞特征主要有一下几个方面：a)基因组的不稳定和变异，b)肿瘤促进炎症,c)能量代谢过程的改编和d)肿瘤细胞对于免疫侵害的规避（图
1）。[7]
2.2 生物标记物
生物分子标记物或生物标记物的种类很多，一般包括变异的基因、RNA、蛋白质、脂质体、糖类和小分子的代谢产物，以及它们所引起的与生物行为或临床表现相关的选择性表现型。大部分的生物标记物是通过基于分子结构与肿瘤行为的关系的分子图谱研究发现的。例如在乳腺癌和前列腺癌中，所谓致命表现型的出现就是一个严重的现象，这些表现型包括骨转移、荷尔蒙独立性以及辐射和化疗抗性表现型。目前，我们普遍假设这些具有严重侵害性的肿瘤行为或表现型可以通过特定的生物标记物来理解和预测。通过进一步明确生物标记物与肿瘤表现型之间的关系，基于个体患者的分子谱图我们将能够使得对肿瘤的诊断和预后成为可能，并形成个性化和具有预测性的治疗方案，即就是说，一个特定的分子谱图可被用于预测肿瘤细胞的侵害性和在缺乏雄激素和缺氧的新陈代谢条件下存活及生长的潜在能力，另外还有特定的肿瘤细胞规避宿主免疫反应的潜能。
目前用于肿瘤诊断检测的标记物主要分为两类：a)基因标记物和b)蛋白质生物标记物。我们知道，细胞发生癌变的本质是细胞内遗传物质的改变。所有人类体内都存在癌基因，癌症病人与健康人群的区别在于癌症病人的癌基因异常表达，抑癌基因丢失或失去活性。例如，结肠癌是因正常的上皮细胞发生APC基因的丧失或突变，DNA甲基化异常，Ras基因突变和DCC、p53基因丧失等基因改变而形成
肿瘤。[6]
现在随着PCR方法的进一步普及
与发展，临床上利用基因扩增检测异常基因的方法已有越来越广泛的应用。另外，作为基因表达的产物，在正常细胞发生癌
变，基因异常表达时，其所对应编码的蛋白质也会随之改变。大量研究表明，某些蛋白质在肿瘤组织中的表达高于正常组织中的表达水平。于是，这些蛋白质生物标记物就被应用于肿瘤疾病的检测和诊断，且已成为目前肿瘤检测诊断领域的一项重要工具。[8]
这种检测的基本原理主要是利用肿瘤特异性抗原与其对应抗体的特异性结合，从而引发后续一系列特异性反应产生可被检测到的信号。另外，其它领域的发展与相互借鉴在肿瘤检测诊断过程中也发挥着重要作用。例如，目前通过蛋白质组学与其他技术的结合来实现检测，如凝胶电泳、液相层析、质谱和核磁共振技术等。对于不同的肿瘤细胞，其表达的生物标记物的种类和含量也有所不同，例如PSA为前列腺癌的生物标记物，前列腺癌患者血清中PSA会有所升高；CA125为卵巢癌的生物标记物；AFP为肝癌的标记物等。[6]表1中列出了目前已知的用于肿瘤检测诊断和预后的标记物。[9]在具体的肿瘤检测过程中，这些常
用的肿瘤标记物都有其对应的阈值。
[10, 11]对于这些肿瘤蛋白质标记物的检测以作为判断病人是否患有肿瘤疾病的常用辅助手段。
表1 已知与肿瘤诊断和预后相关的生物标记物
Tab.1 Known biomarker associated with cancer
[9]
3 磁性纳米颗粒的应用
3.1 磁性纳米颗粒
超顺磁性氧化铁纳米颗粒是一类能够很好的应用于生物医药领域的生物材料。它具有一系列其它宏观材料所不具备的优良性质，如小尺寸效应、良好的磁导向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基团等特点，在生物医学领域已表现出独特的优势，具有潜在的应用前景，如磁靶向药物、固定化酶、细胞分离和免疫分析、基因治疗。[12]目前大多数磁性纳米生物材料的研究还处于动物实验阶段。其在肿瘤检测诊断方面的应用一般基于对合成的纳米颗粒进行表面改性，从而使其表
面带有可与特定生物标记物发生反应的功能基团、可与肿瘤表面特异性表达的基团或抗原发生特异性反应的抗体，从而与相应的肿瘤标记物发生反应产生可被检测到的信号。[13-18]
目前超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）的化学制备方法只要分为水相和有机相合成两大类：前者主要包括共沉淀法、水热法、氧化沉淀法等；后者则包括高温分解法、微乳化法、溶胶-凝胶法、多元醇法等。[19]此外，还可利用电化学方法、激光热解技术制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
3.2 SPION的结构及应用
图2 巨磁阻传感器的原理示意图
Fig. 2 Schematic principle of the giant magnetoresistive sensor
SPION的表面改性修饰主要是利用其制备方法所带来的其本身的性质，通过化学方法在其表面通过化学键连接一层或数层聚合物分子层，并在这一聚合物分子层上再通过化学或物理方法连接上具有特定功能的抗体或其它功能基团。不过，现在已经发展了其它更有效的方法来修饰SPION，以期获得更好的生物医学领域的应用。张越等
[13]
通过在磁性颗粒表面
通过化学键合的方式连接上特异性抗体制成传感器，用于靶向定位。这种检测方法与传统的酶联免疫吸附试验相比，具有以下优点：a) 更有效地靶向目标捕获率和更好的键合亲和性；b) 更快的动力学
速度；c) 更有效的信号放大功能。目前的安久主要有基于纳米颗粒条码的检测、纳米传感器检测和巨磁阻传感器检测（图2）。但是由于其自身的限制，该检测分析法只能检测大分子目标，而对小分子靶向目标则束手无策。所以他们更进一步研究了配体/磁性粒子传感器，并得出，相比上述抗体/磁性粒子传感器其更具有优越性，这种传感器可实现更广范围的靶向目标检测，不仅包括大分子，而且对小分子、金属离子、DNA、蛋白质甚至整个细胞都可实现检测，这主要得益于其配体分子的可设计性。[13]
图3 利用磁光夹心结构筛选DNA和蛋白质示意图
Fig. 3 Schematic illustration of DNA and protein screening applications of magnetooptical sandwich assay
Yang等[20]采用一对分子探针分别连接荧光光学条码（彩色）和磁珠（棕色），对DNA（顶端镶板）和蛋白质（底截镶板）生物分子进行目标分析（图3）。如果目标DNA序列或蛋白质存在，它将与两个磁珠结合一起，形成一个三明治结构，经过磁选，光学条码可以在单磁珠识别目标水平下，通过分光光度计或是在流式细胞仪读出。通过此方法检测目标分子是基于数百万个荧光基团组成的微米尺寸光学条码信号的扩增而检测出来，其基因和蛋白的检出限可达到amol/L量级，甚至更低。
图4 比色法生物条形码检测示意图。
Fig. 4 Colorimetric bio-barcode assay. (A) Probe preparation and electron micrograph images of amine-modified porous silica beads
(inset). (B) Interleukin-2 detection scheme.
Nam等[21]利用多孔微粒法（每个微粒可填充大量条形码DNA）和金纳米颗粒为基础的比色法生物条形码检测技术检测了人白细胞介素2，检出限可达到30amol/L，比普通的酶联免疫分析技术的灵敏度高3个数量级。Oh等[22]利用荧光为基础的生物条形码放大方法检测了前列腺特异性抗原（PSA）的水平，其检出限也低于300amol/L，而且实现了快速检测。
在免疫检测中，磁性纳米粒子一般作为抗体的固相载体，粒子上的抗体与特性抗原结合形成抗原抗体复合物，在磁力作用下，使特异性抗原与其它物质分离，克服了放免和酶联免疫测定方法的缺点。这种分离具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点。Yang等[23]通过
反相微乳液法制备了粒径很小的SiO2包覆的Fe3O4磁性纳米粒子，生物分子通过诱导这些高单分散的磁性纳米粒子可用于酶的固定和免疫检测。
图5 （A）磁性纳米颗粒和免疫功能化的磁性
纳米颗粒的合成；（B）T细胞的检测；（C）各种细胞图例。
Fig. 5 (A) Synthesis of MNPs and immunofunctionalized MNPs. (B) The schema illustrates the process for detection of specific T helper cells using two biomarkers: immunofunctionalized MNPs for immunoseparation and the ELISA technique for detection. Absorbance was recorded at a wavelength of 650 nm. (C) Diagrammatic representations of the T helper cells, B cells, and other materials.
Abbreviations: MNPs, magnetite nanoparticles;
ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; HRP-stv, horseradish peroxidase-streptavidin; TMB, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine.
Cheng等[15]通过对共沉淀法制备的磁球表面连接APTES和CD-4来实现在较低浓度下快速、灵敏的检测癌细胞，该方法可同时检测出T helper cancer cells的两个标记物：一个与免疫功能化的磁纳米粒结合以利于细胞的分离，另一个用于酶联免疫检测（图5）。
通过对磁性纳米颗粒的功能化，如连接适当的配体、抗体或蛋白质，这种功能化的磁性纳米颗粒将具有特异的选择性，从而而被应用在蛋白质分离、细菌检测以及毒素降解等方面。[24]同时，对于这种改性的功能化，实际应用时通常会对其结构做一定的设计，以达到其对响应信号的放大，从而更有利于检测。
[14, 16, 25-28]
4 结论与展望
磁性纳米颗粒已经被广泛的应用于生物医学领域，如MRI造影剂、药物载体、磁性传感器以及热疗探针等。本文主要讲了其在生物检测领域，特别是作为生物探针的应用。尽管对于这些纳米颗粒所具有的生物应用潜能有基本共识，但在实现其临床应用之前仍有一系列关键性问题需要解决。其中之一就是对这种磁性纳米颗粒的粒径尺寸和磁性可控性的掌握。实现单分散性、粒径均一、合成方法简便、批量生产以及低成本的磁性纳米颗粒的生产是临床应用前亟待解决的问题。
磁性纳米粒子的细胞毒性和生物毒性是我们需要特别关注的另一个方面。在体内，裸露的磁性粒子会产生一系列潜在的毒性影响，如炎症反应、细胞的程序性
凋亡、线粒体功能损伤、细胞膜乳化脱氢酶缺失、染色体损伤以及染色体收缩等。因此，磁性纳米颗粒的生物相容性和生物安全性需要给予特别的关注。
另外，磁性纳米颗粒进入体内后的生物有效性也是其应用前景的一个重要因素。进入体内后与靶向组织或细胞最大限度地发生特异性反应而尽可能减小或消除其他组织或细胞对其的吸收，这对纳米颗粒进入体内之后的生物有效性至关重要。
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