第27卷 第5期生物医学工程学杂志Vol.27 No.5
2010年 10月JournalofBiomedicalEngineeringOctober 2010
SGC7901胃癌细胞株中高尔基体的分离及鉴定
何婷婷
1,2
＊
易永芬
1,2Δ
李艳青
1,2
肖 钟
1,2
1(重庆医科大学病理科,重庆400016)
2(重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆400016)
摘 要:高尔基体作为主要的分泌细胞器,其功能复杂。从细胞内分离出纯度较高的高尔基体有利于对其功能的深入研究。通过胃癌细胞SGC7901的大量体外培养,差速离心结合蔗糖密度梯度离心法纯化分离出高尔基体后,电镜及中性红超活染色进行形态学鉴定,高尔基体标志酶半乳糖基转移酶Galse及硫胺素焦磷酸酶TPPase活性测定进行纯度分析,首次从胃癌细胞SGC7901内成功分离出纯度较高的高尔基体,为对高尔基体功能的深入研究奠定基础。
关键词:高尔基体;胃癌细胞;亚细胞器分离;蔗糖密度梯度离心
中图分类号 Q813 文献标识码 A 文章编号 1001-5515(2010)05-1085-04
TheIsolationandAssessmentofGolgiApparatusfrom
GastricCancerCellsSGC7901
HeTingting
1,2
YiYongfen
1,2
LiYanqing
1,2
XiaoZhong
1,2
1(DepartmentofPathology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
2(MolecularMedicineandCancerResearch,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
Abstract:TheGolgicomplexisthecentralorganelleofthesecretorypathwayandhasmanycomplicatefunctions.TheendeavourstoisolateandpurifytheGolgiapparatusfromculturedcellswillbenefitfurtherinvestigationofGol-gi.AlargenumberofgastriccancercellsSGC7901werecultivatedinvitro,thenGolgiapparatuswereisolatedfromthecellsbydifferentialcentrifugationcombinedwithsucrosedensitygradientultra-centrifugation.Itspuritywascharacterizedbiochemicallybyenzymaticassays,morphologicallybyelectronmicroscopy(EM)andneutralredsu-pravitalstaining.FinallytheGolgicomplexwassuccessfullyfractionatedfromgastriccancercellsSGC7901.ThefirstsuccessfulisolationofGolgiapparatusfromgastriccancercellsSGC7901byusingultra-centrifugationwillleadtoresearchintothefunctionofGolgiapparatus.
Keywords:Golgiapparatus;Gastriccancercell;Subcellularseparation;Sucrosedensitygradientultra-centrifugation
引言
高尔基体是一种分泌性细胞器,功能复杂,其主要功能是将内质网合成的蛋白进行加工修饰,并运
输到细胞特定部位发挥功能[1]。目前亚细胞器蛋白质组学的广泛开展,亟待纯化的细胞器的分离,能成功从细胞中分离出高尔基体不仅是亚细胞器蛋白质组学的基础,也为深入了解高尔基体的蛋白成分及功能提供了可能。
高尔基体的分离仍然是目前的一个难点。主要
＊国家自然科学基金资助项目(30672431);教育部博士点基金资助项目([1**********])
:@因为高尔基体的低丰度,如每10g肝脏组织中约有
15mg高尔基体[2],另外高尔基体的含量还随细胞类型的改变有较大差异。其次,因为高尔基体与内质网联系紧密,往往不容易将两者完全区分。故要想获得完全纯的高尔基体是不可能的。从组织中分离纯化高尔基体的方法目前国外报道较多,尤其是从大鼠肝脏分离高尔基体研究得最为广泛[4,5]。这是因为大鼠肝脏的易得性和易操作性使其成为高尔基体的理想来源,而从培养细胞中分离高尔基体的方法却鲜有报道,目前国内外均没有从胃癌细胞中分离高尔基体的相关报道。前期研究发现在高分泌的胃癌细胞中高尔基体囊泡扩大。故本实验欲[6]
[3]
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尔基体,并对分离物进行形态学及酶学鉴定。这将有利于我们对高尔基体功能的深入研究,并有利于高尔基体的亚细胞器蛋白质组学的开展。
液的2.5%戊二醛中固定4h,然后用1%锇酸(内含0.1mol/L磷酸钠缓冲液,pH7.2)于4℃处理1～2h,用一系列的丙酮脱水并包埋于多孔橡胶包埋模板
中,将超薄切片用柠檬酸铅染色,透射电镜观察。②中性红超活染色:将最终沉淀物的极少量涂在载玻片上,滴入1/3000中性红染液1滴,避光染色5～10min,吸去染液,滴一滴Ringer液(氯化钠0.85g/100ml、氯化钾0.25g/100ml、氯化钾0.25g/100ml、氯化钙0.03g/100ml),盖上盖玻片光镜检查。实验重复三次。1.5.2 酶学鉴定 半乳糖基转移酶(galactosyl-transferase,Galse)及硫胺素焦磷酸酶(thymidine-5′-triphosphatesuccinatedehydrogenase,TPPase)作为高尔基体标志酶,5′-核苷酸酶(5′-nucleotid-ase)、琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase)、NADPH-细胞色素C还原酶(NADPH-cytochromeCReductase)分别作为细胞膜、线粒体、内质网膜含量的指标,进行高尔基体纯度鉴定。半乳糖基转移酶以半乳糖为受体,按文献[8,9]检测,硫胺素焦磷酸酶活性测定的方法基本按文献[10]操作,后三种酶的测定按文献[9]操作。所有酶活性实验均重复三次。
1 材料和方法
1.1 材料
胃癌细胞株SGC7901购于重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心。1.2 主要试剂和仪器
蔗糖,Tris-HCl,NaEDTA,硫胺素焦磷酸,三磷酸腺苷,腺苷-5′-单磷酸,琥珀酸钠,碘硝基四唑紫,NADPH,细胞色素C,中性红购自上海生物工程公司;UDP-[6-H]-galactose,卵清蛋白购于Sigma公司。BeckmanL7型超速离心机为Beckman产品。液体闪烁计数器为美国贝克曼库尔特有限公司产品。1.3 细胞培养及收集
胃癌细胞株SGC7901培养于含10%血清的RP-MI1640培养基中,生长至对数期,0.25%胰酶消化井收集细胞,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次,细胞计数。1.4 高尔基体的分离纯化
基本按《细胞实验指南》和Lionel操作,并有一定改进。其操作简述之如下(注:未加特别说明,所有操作均在4℃下进行)。
1.4.1 匀浆化处理及细胞破碎 约0.9×10～3.5×109细胞溶于适量匀浆介质(0.25mol/L蔗糖,10mmol/LTris-HCL,pH7.4,内含少量蛋白酶抑制剂)中,混匀,用Dounce匀浆器匀浆该混合物,倒置相差显微镜观察,当90%以上的细胞破碎时,停止匀浆。
1.4.2 差速离心 上述匀浆液在1000g下离心约10min,弃沉淀(主要为细胞核及碎片),收集上清液,该上清液称为去核上清液(postnuclearsuperna-tant,PNS)。
1.4.3 蔗糖密度梯度离心 在一个4ml的SW管中先加入2.5ml1.2mol/L蔗糖(pH6.4,含0.05mol/LTris-HCl),上面覆盖PNS,在一SW27水平转头中以10000g,4℃下离心1h。用巴氏德吸管将位于1.2mol/L蔗糖及PNS间的薄层乳白色物质,即高尔基体提取物(Golgifraction,GF),小心吸出并重悬于匀浆介质中,以12000转/min,4℃离心30min收集沉淀。
1.5 高尔基体的鉴定1.5.1 形态学鉴定 ①电镜:将离心后的最终沉淀7,1/9
[2]
[7]
3
2 结果
2.1 从胃癌细胞SGC7901分离所得高尔基体的电镜结果
如图1所示,图片显示为一些大小不一的囊包
状结构,背景为一些均质状物质。虽未见到三层膜囊样的高尔基体典型结构,但箭头所示为大小不一的高尔基体囊泡。另外也未见到细胞核,内质网及线粒体等细胞器结构。2.2 中性红超活染色
结果如图2所示,高尔基体被中性红特异性染为玫瑰红色,呈片状分散分布。
2.3 酶学分析结果
如表1所示,经密度梯度离心纯化后,胃癌细胞SGC7901高尔基体的TPPase比活力提高了98倍,即高尔基体纯度较之胃癌细胞粗匀浆液提高98倍,Galse的比活力提高了107倍,这也说明高尔基体较之粗匀浆液富集了约107倍。同时,与细胞粗匀浆液相比,纯化高尔基体中已测不出琥珀酸脱氢酶的比活力,因此,来自线粒体的蛋白质杂质基本清除;5′-核苷酸酶及NADPH-细胞色素C还原酶比活力数据说明,细胞膜碎片和内质网膜碎片虽然在纯化的高尔基体中存在,但含量极少,可忽略。
第5期 何婷婷等:SGC7901胃癌细胞株中高尔基体的分离及鉴定
1087
图1 胃癌细胞SGC7901高尔基体的电镜图像
(a)放大倍数8900;(b)放大倍数12500(图中箭头所示为大小不一的高尔基体囊泡)
Fig.1 ElectronmicrographsofGolgifraction(GF)isolatedfromSGC7901cells
(a)magnification×8900;(b)magnifiction×12500(ThearrowheadssymbolindicatedvariousGolgivesicles
)
3 讨论
获得高尔基体的理想来源主要是大鼠肝脏。以大鼠肝脏分离而得的高尔基体主要用于其功能研究,如蛋白质组学以鉴定出其中的主要蛋白。因高
尔基体功能复杂,推测高尔基体上应有1000多种蛋白质,但目前已知的却只有五六百种[4]。故能获得比较纯的高尔基体是对高尔基体蛋白及功能深入研究的基础。从组织中获得高尔基体与从培养细胞中分离高尔基体方法的几点不同主要在于:(1)因高
图2 胃癌细胞SGC7901高尔基体的中性红超活染色(10×10)Fig.2 SupravitalstainingwithneutralredofGolgifraction(GF)iso-latedfromSGC7901cells(10×10)
表1 分离高尔基体的酶学分析结果Tab.1 EnrichmentoforganellarmarkersinGF
纯化指标
TPPase特异性活性
Galse特异性活性5′-核苷酸酶特异性活性NADPH-细胞色素C还原酶特异性活性
琥珀酸脱氢酶特异性活性高尔基体纯化倍数
定位高尔基体高尔基体质膜内质网线粒体
高尔基体
细胞匀浆
分离物0.130.241.780.580.70
12.74
25.680.120.09 ND98#107&
尔基体在细胞内的含量极少且随细胞类型不同又有所不同,因而从细胞中分离获得高尔基体就要求培养的细胞数量至少在109数量级。对于贴壁细胞而言,培养工作是非常巨大的。故在本实验中采取体外分批分次大量培养所需细胞,以达到所需的细胞数量,为从细胞内成功分离出高尔基体做好准备。(2)从细胞中获得高尔基体的优点是细胞类型的单一性,可以避免其他细胞的干扰。而从组织中分离高尔基体,就极有可能混有其他细胞类型,需要进行优化处理,如从大鼠乳腺组织中获得高尔基体就得先收集腺泡,再从腺泡中分离高尔基体[3]。本实验首次报道了从胃癌细胞SGC7901中分离纯化高尔基体的方法,并且在对高尔基体的形态学鉴定中引入中性红这种超活染色技术,对高尔基体的验证做 注:ND,未检测出;#,高尔基体分离物的TPPase特异性活性与细胞匀浆的TPPase特异性活性的比值;&,高尔基体分离物的Galse
1088 生物医学工程学杂志 第27卷
本实验中通过电镜进行形态学鉴定过程中,我们发现从细胞中分离高尔基体的电镜图和从鼠肝中分离的高尔基体的电镜图有所不同,但和从大鼠乳腺组织中分离的高尔基体电镜图却极为相似
[12]
[11]
channels[J].JBiolChem,2009,284:2844-2853.
[2][3]
黄培堂译著.细胞实验指南(上册)[M].北京:科学出版社,2001:335-346.
WUCC,YATESJR,NEVILLEMC,etal.Proteomica-nalysisoftwofunctionalstatesofGolgicomplexinmammaryegithelialcells[J].Traffic,2000,1:769-782.
[4]
TAKATALOMS,KOUVONENP,CORTHALSG,etal.IdentificationofnewGolgicomplexspecificproteinsbydirectorganelleproteomicanalysis[J].Proteomics,2006,6:3502-3508.
[5]
LOWENTHALMS,HOWELLKE,WUCC.Proteomica-nalysisofthestackedGolgicomplex[J].MethodsMolBiol,2008,432:37-49.
[6]
YIYF,MAODL,HUANGYR.Arylsufatasβ-galactosi-daseandlysozymeingastriccancercellsanditsrelationshiptoinvasion[J].WorldJournalofGastroenterology,1998,4(1):52-54.
[7]
BREUZAL,HALBEISENR,JENOP,etal.Proteomicsofendoplasmicreticulum-golgiintermediatecompartment(ER-GIC)membranesfrombrefeldinA-treatedhepG2cellsidenti-fiesERGIC-32,anewcyclingproteinthatinteractswithhu-manErv46[J].TheJournalofBiologicalChemistry,2004,279:47242-47253.
[8]
TUMBALEP,JAMALUDDINH,THIYAGARAJANN,etal.Screeningalimitedstructure-basedlibraryidentifiesUDP-GalNAc-specificmutantsofα-1,3-galactosyltransferase[J].Glycobiology,2008,18:1036-1043.
[9]
GRAHAMJM,HIGGINSJA.BiomembraneprotocolsⅠ.Isolationandanalysis[M].Totowa:Methodsinmolecularbiology.HumanaPressInc,1993,19:100-102.
[10]
REDDYVS,SINGHAK,RAJASEKHARANR.Thesac-charomycescerevisiaePHM8geneencodesasolublemagnesi-um-dependentlysophosphatidicacidphosphatase[J].JBiolChem,2008,283:8846-8854.
[11]
RANDALLST,STEVENMJ,ROLFHD,etal.Charac-terizationofthegolgicomplexclearedofproteinsintransitandexaminationofcalciumuptakeactivities[J].MolBiolCell,1997,8:1911-1931.
[12]
LIPSKYNG,PAGANORE.AvitalstainfortheGolgiap-paratus[J].Science,1985,228:745-747.
(收稿:2009-10-12 修回:2009-12-10)
———即高尔基体呈去堆积现象。非常典型的
高尔基体的三层膜囊结构的消失,这是因为一般来
说,很难找到一个策略可以在匀浆处理和最初的离心沉淀之前,既使培养的哺乳动物细胞破碎又不导致高尔基体的破坏和额外的损失
[2]
。细胞的匀浆化
处理会导致匀浆液中缺乏形态上可识别的高尔基体复合物。从细胞中分离高尔基体时,由于细胞器破裂不能见到完整的高尔基体结构,只可能是一些高尔基体碎片,故我们采用了中性红超活染色法,该方法是高尔基体形态学上的一个极好的补充手段。该方法是我们首次引入作为高尔基体的鉴定。因中性红是弱碱性染料,它对液泡系结构(高尔基体)有特异性染色作用。该染色功能与高尔基体结构是否完整无关,所以通过该实验的补充,进一步验证了我们所分离的为高尔基体。
此外我们做了高尔基体的两个标志酶,即Galse和TPPase。从实验结果可以看出与细胞粗匀浆液相比,这两种酶的富集浓度都大大提高了,说明高尔基体得到有效富集。另外其他可能污染的细胞器如线粒体、内质网、质膜的标志酶也同时检测了,可以看出这些酶在我们所分离出的细胞器中的浓度极少,可以忽略。
综上均可以看出通过我们的实验,成功的从胃癌细胞SGC7901中分离纯化出高尔基体。该实验方法将有利于我们对胃癌细胞内的高尔基体功能做进一步研究。
参
[1]
[12]
考文献
BRIANPD,HEATHERAS,BROOKEM,etal.SmallGTPasedeterminantsfortheGolgiprocessingandplasmale-mmalexpressionofhumanether-a-go-gorelated(hERG)K+