第27卷第5期2010年10月
生物学杂志JOURNAL OF B I O LOGY
V o. l 27 N o . 5
O ct , 2010
do i 10. 3969/j issn 1008-9632. 2010 05 084
禽流感治疗药物研究进展
李
存, 童贻刚
(军事医学科学院微生物流行病所国家重点实验室, 北京100071)
摘 要:禽流感是由正黏液病毒科甲型流感病毒引起的对人类健康和社会发展构成极大威胁的烈性传染病, 高致病性禽流感暴发突然, 具有极高的发病率和死亡率。目前具有确切疗效的抗禽流感治疗药物品种很少, 公认的药物只
有奥塞米韦, 此外流感病毒的抗药性也是一个重要的问题, 近年来出现的甲型H 1N 1病毒更给人类敲响了警钟, 因此研究更多的治疗药物和治疗手段对于禽流感的防控十分必要。从禽流感治疗化学药物和生物药物几个方面对禽流感治疗研究进展进行了综述。
关键词:禽流感; 抗禽流感病毒药物; 药物靶点中图分类号:R978. 7文献标识码:A
文章编号:1008-9632(2010) 05-0084-04
Progress on research of anti avian i nfl uenza virus agents
L I Cun , TONG Y i gang
(State K ey Laboratory of Pathogen and B i osec urity , D e part m ent of Pathoge n i c M o lecular B i o l ogy , Beijing
I nstitute ofM icrobiology a nd Epi de m i ology , Beijing 100071, Chi na)
Abstrac t :A v ian i n fluenza is a v i o lent infecti on caused by o rt ho m yxov i r i dae type A i nfl uenza v irus wh ich constitutes a great threat on hu m an hea lth and t he deve l op m ent o f so ciety . H igh l y pat hogen ic av i an i n fluenza (HIPA ) has a very high l eve l of mo rbidity and mo rtal
ity and outbreaks unexpected l y . F e w spec ies o f anti av i an i n fluenza v irus agents takes on ex act effec t no w adays , a m ong of wh i ch ose lta m i v ir i s the on l y one recognized . T he drug resistant o f i nfl uenza v i rus i s also an i m po rtant issue , and the com i ng o fH 1N 1i nfl uenza A v irus g ives a fire a lar m to t he people , so it is necessary to research m ore anti v iral agents and t herapeuti c too ls to prevent and contro l of av ian i nfl uenza v irus . In th i s rev ie w, the progress in research of anti av i an i nfl uenza virus agents i nc l udi ng che m i ca ls and b i o l og ic a gents w ere focused . K eywords :av i an i nfl uenza v irus ; anti av ian i nfl uenza v i rus agents ; targ et f o r drugs
禽流感(avian influenza , A I) 是由甲型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病, 严重危害人类健康和畜牧业的发展, 并严重影响国家的经济发展。禽流感病毒(avian i nfl uenza vir us , A I V ) 基因组极易发生变异, 造成病毒的多型性, 给禽流感防治带来极大难度。据WHO 最新报道, 截至2009年7月1日, 全世界已确诊436人感染H5N 1亚型高致病性禽流感, 死亡262人, 病死率为60. 1%。目前还不清楚哪些特异突变可以使H5N 1病毒能够容易并稳定地在人-人之间传播, 但是其一旦发生H5N1病毒突变并获得对人的特异性, 将会对人类造成重大危害, 2009年3月墨西哥和美国等先后发生的可以人传染人的甲型H 1N1流感就是一个警示。因此, 对禽流感的研究和控制已刻不容缓。
收稿日期:2009-08-08; 修回日期:2009-10-12作者简介:李
存(1984-), 男, 汉, 研究生, 专业方向:抗体工程;
通讯作者:童贻刚, E m ai:l tong . yi gang @gma i . l co m 。
人们对于禽流感的预防与治疗主要集中在疫苗和抗病毒药物两种方法上, 疫苗是一种有效抑制流感病毒
的手段, 但从疫苗注射到产生保护性抗体需要较长时间, 更重要的是由于流感病毒的抗原变异性, 使得疫苗的有效性显著降低, 这往往会影响控制流感的效果。疫苗的这些不足使得抗禽流感病毒药物的研究显得十分必要, 它们可以同时起到预防和治疗的作用, 从而最大程度的降低了禽流感病毒的威胁, 目前用于临床的对禽流感病毒有效的药物主要有离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂两大类。另外, 近两年来有关禽流感被动免疫预防和治疗的研究是禽流感研究的热点之一, 使用抗体制剂对禽流感进行被动免疫预防和治疗也是一条极具潜力的手段, 使用其之后可以立刻产生防护效果, 从而弥补了疫苗的不足。1禽流感病毒
1. 1 禽流感病毒病原学特征
流感病毒属正黏液病毒科(O rtho myxoviri dae), 是一
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种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA 病毒, 基因组分
为8个节段, 这一特点使其在复制过程中极易发生基因重组, 导致新病毒株的出现。禽流感病毒一般为球形, 直径为80~120nm, 禽流感病毒的8个基因片段编码10个病毒蛋白, 其中8个是病毒粒子的组成成分(HA 、NA 、NP 、M 1、M 2、PB1、PB2和P A ), 另两个是分子质量最小的RNA 片段, 编码两个非结构蛋白 NS1和NS2。流感病毒根据核蛋白(NP ) 和基质蛋白(M 1) 抗原性的不同, 分为甲、乙、丙3个血清型, 禽流感病毒属于甲型流感病毒。病毒囊膜表面的血凝素蛋白(HA ) 和神经氨酸酶(NA ) 是流感病毒的主要抗原, 依据HA 和NA 的不同, 甲型流感病毒可进一步分为16个H (H1 H16) 亚型和9个N (N1 N 9) 亚型, 在甲型流感病毒众多亚型中, H 5和H7亚型为高致病性禽流感病毒。1. 2 致病机理
禽流感病毒通过HA 与细胞受体相互作用而与细胞膜结合之后, 包膜和病毒形成的复合物就会被细胞内
+
吞, 然后H 进入内吞泡, 再经酸化作用, HA 构象发生变化, 使病毒和内涵体膜相互靠近并发生融合。为使病毒RNA 释放至胞质中, 酸性内涵体中的H 利用M 2离子通道进入病毒颗粒内部。随后, 病毒RNA 进入细胞核进行转录和翻译, 次黄嘌呤核苷酸、病毒RNA 聚合酶抑制剂、s i R NA 可以干扰此过程的进行。最后, 流感病毒NA 作用于宿主细胞表面的唾液酸受体, 使其从细胞的结合位点上裂解释放, NA 抑制剂可阻止子代病毒颗粒的释放, 从而抑制病毒的继续感染, NA 还可能在病毒感染呼吸道上皮细胞的早期阶段发挥作用。最近, Paler mo [1]
等以人支气管上皮细胞和人副流感病毒(HPI V 3) 为模型, 研究了HA 和NA 的! F tri ggeri ng ∀机制, ! F tri gge ri ng ∀异常会抑制病毒感染, 并认为其可作为靶点设计新的抗病毒药物。
2抗禽流感化学药物研究进展
目前抗禽流感化学药物研究主要集中在神经氨酸酶抑制剂、离子通道抑制剂和RNA 聚合酶抑制剂, 分别以神经氨酸酶、M 2离子通道和RNA 聚合酶为作用靶点。另外, 联合使用不同活性机制的抗病毒药物治疗禽流感的研究也表现出很大的前景。2. 1 神经氨酸酶抑制剂
神经氨酸酶(NA ) 在A I V 致病过程中有重要作用, NA 切割宿主细胞表面的唾液酸受体, 使流感病毒从细胞的结合位点上裂解释放, 促进新形成的病毒颗粒从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散, 神经氨酸酶抑制剂可抑制流感病毒裂解释放的过程, 从而阻止病毒继续感染其他细胞。Eichel berger 等报道了一种以NA 为靶标的高通量抗流感病毒药物筛选方法, 不仅适用于高通量筛选潜在的抗病毒药物, 还可用于鉴定抗药性流感病毒[2][3]
株。Russell 等研究发现N 1亚型的NA 三维结构与
+
N 2、N 9亚型有明显的区别, 最主要的不同发生在NA 保守区附近的150位置, 这为新型神经氨酸酶抑制剂的研究提供了思路。2. 1. 1 扎那米韦
扎那米韦(zana m ivir) 是第一个神经氨酸酶抑制剂类流感病毒药物, 它是NA 天然底物唾液酸的近似模拟物, 它能特异地抑制神经氨酸酶多种亚型禽流感病毒。扎那米韦有较好的安全性, 急性毒性低, 静脉注射扎那米韦也可有效抑制高致病性H5N 1病毒的感染, 但最近
[4]
H ata 等研究发现, 扎那米韦能明显抑制人神经鞘2(NEU 2) 和神经鞘3(NEU 3) 唾液酸酶活性。2. 1. 2 奥塞米韦
奥塞米韦(oselta m i v ir) 是第二个上市的神经氨酸酶抑制剂, 它是NA 的强效选择性抑制剂, 对甲型流感病毒具有良好的治疗和预防效果。一项以雪貂为对象的研究中, 一定剂量的奥塞米韦可完全抑制H 5N1的复制,
[5]
并有100%的保护率。口服奥塞米韦的抗病毒作用超过金刚烷胺和金刚乙胺, 但A I V 容易对奥塞米韦产生耐药性, 有文献报道其耐药性与神经氨酸酶蛋白的突变有关
。
由于世界范围内H 5N1禽流感的流行以及H 5N 1抗药性的产生, 以结构为基础设计新型H 5N1神经氨酸酶
[7]
抑制剂的技术成为现在研究的热点。Du Q S 等通过修饰奥塞米韦相关基团获得了6种对奥塞米韦H 5N1抗
[8]
性株有抑制活性的抑制剂。最近, D #Souza 等利用甘氧酰基、乙酰基、苄基和脯氨酰基修饰奥塞米韦得到了几种新的奥塞米韦衍生物, 核磁共振技术(N M R) 和差示扫描量热法分析显示, 甘氧酰基衍生物与细胞膜模型的作用明显。
2. 1. 3 帕拉米韦
帕拉米韦(pera m i v ir) 由美国亚拉巴马州生物结晶医药公司开发, 该药物对包括H5N 1、H 1N1在内的多种流感病毒都有良好效果, 对耐受奥塞米韦和扎那米韦的甲型、乙型流感病毒株也有活性。H5N 1病毒小鼠模型研究证实, 注射帕拉米韦可有效抵抗致命剂量的感染,
[9]
Y un 等人也发现, 注射帕拉米韦可降低肺和脑部的病毒滴度, 增强小鼠和雪貂抵抗H 5N 1病毒感染的能力。帕拉米韦以使用方便、作用时间长、药效强、易生产等特点, 可能会成为新一代主流的抗流感病毒药物。2. 1. 4 其他神经氨酸酶抑制剂
近几年人们对多种化合物的神经氨酸酶抑制活性进行了研究。Ryu 等[10]研究了柘木中的双苯吡酮类化合物和苦参中的紫檀碱的神经氨酸酶抑制活性。Sever
[11]
son 等则利用高通量化合物筛选技术筛选到了几种具有抗H 3N2活性的新型化合物, 新近H ung 等也进行
[12]
了类似的研究, 筛选到一种NA 抑制剂金精三羧酸(ATA ), 该化合物可有效抑制NA 的活性。
[6]
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2. 2 离子通道抑制剂
金刚烷类药物为M 2离子通道抑制剂, 是传统的治疗甲型流感病毒药物, 通过阻碍病毒膜M 2蛋白形成离子通道, 而干扰病毒的脱壳过程。
金刚烷胺是人类第一个抗流感病毒药物, 由D uPont 化学公司研制成功, 金刚乙胺是金刚烷胺的衍生物, 金刚乙胺与金刚烷胺对人类H1N 1、H 2N2和H 3N2亚型均有效, 但其对神经系统的副作用以及抗药性病毒株的迅速出现限制了它的广泛使用。除了金刚乙胺与金刚烷
[13]
胺, 近几年有研究显示, 很多金刚烷胺类衍生物也表现出抗甲型流感病毒活性, 而且其表现出比金刚烷胺和金刚乙胺更强的抗甲型流感病毒活性。2. 3 流感病毒RNA 聚合酶抑制剂
流感病毒RNA 聚合酶是由病毒编码的多肽(PB1、PB2、P A ) 构成的三聚体, 病毒的多聚酶复合基因导致了H5N 1禽流感病毒的高致病性, 这一发现强调了以多聚酶为靶点研究新型预防治疗人和禽流感病毒感染药物的价值。已经有少数几种以RNA 聚合酶为作用位点抑制病毒活性的化合物, 包括L 742, 001[14]、T 705[15]等, 其中L 742, 001可以强烈抑制病毒的再生, 对扎那米韦抗性株和野生株具有相似的活性, T 705具有毒性低、半衰期较长的特点, 可能会发展成为新一代抗流感药物。2. 4 联合治疗药物
联合使用不同活性机制的抗病毒药物治疗流感可能通过附加效应或协同效应有效抑制病毒复制, 并可减少用药剂量, 从而降低药物毒性和抗药株出现的频率。有研究发现, H 1N 1、H3N 2和H5N 1病毒对金刚烷胺或奥塞米韦都可产生抗药性, 但同时使用两者可减少抗性
[16]
株的出现, 并且联合使用奥塞米韦和金刚烷胺治疗
[17]
H5N 1感染比单一用药效果更好。
3 生物药物研究进展
3. 1 干扰RNA 和寡核苷酸治疗
近几年许多体内外研究表明, M 2和N P 的特异si R
[18]
NA 能有效抑制H5N 1病毒的复制。Zhou 等以核衣壳蛋白特异s i R NA 质粒pBa be Super 抑制H5N1病毒mRNA 表达, 结果发现si R NA 可特异的抑制病毒RNA 的聚集, 从而抑制RNA 的转录和复制。
人们对寡核苷酸抑制流感病毒的作用进行的大量研究证实, 病毒特异的RNA 寡核苷酸能有效抑制流感
[19][20]
(H5N1) 病毒的感染。D m i mock 等提出了! protec ting RNA ∀(244RNA ) 的概念, ! protecti ng RNA ∀是自然产生的缺陷型病毒RNA, 与载体结合后可有效抑制H1N 1、H2N 2、H 3N2和H3N 8的感染。Che ng 等通过SELEX 技术也筛选到了对HA 1具有高亲和性、能够抑制H5N 1病毒复制的DNA 适配子(a pta m ers) 。适配子是能特异性地与靶分子结合的单链DNA 或RNA 寡聚核苷酸, 这种寡聚核苷酸被看作为单克隆抗体的替代
[21]
物, 并被认为是唯一在诊断和治疗方面均有用的药品, 可能被发展成一种新型的抗A I V 药物而应用于临床。3. 2 干扰素
干扰素是半个世纪以前以流感病毒为诱因而发现的, 因其能干扰病毒的复制从而得名干扰素。最近, Van
[22]
Hoeven 等在猪体内实验研究发现, 人 干扰素可有效抑制H 5N1和H 1N1的感染, 类似地, Szretter 等也研究发现, ∃型干扰素体内和体外都能有效抑制H 5N1病毒的感染。
3. 3 抗体治疗研究进展
近两年来, 有关禽流感被动免疫预防和治疗的研究是禽流感研究的热点之一, 抗体制剂作为一种被动免疫防护手段, 具有独特的优势。实验证明, 不论是免疫血清或血浆(多克隆抗体) 还是单克隆抗体, 均能对高致病性禽流感产生良好的保护作用。3. 3. 1 多克隆抗体
[24]
Sha hzad 等用禽流感病毒裂解抗原免疫家禽, 获得抗血请注射2周龄小鸡, 然后用致死剂量的病毒进行攻毒, 结果发现, 各种病毒抗原均具有保护作用, 保护效果强弱依次为:核蛋白(nucl eopr ote i n , NP ) >凝血素>神经氨酸酶>核酸聚合酶(pol y m erase , P M ) >非结构蛋白(non str uctural protei ns , N S) 。对欧洲流感大流行的回顾性研究显示, 使用恢复期病人血浆可对禽流感病人产生良好的治疗效果。2007年深圳东湖医院周伯平教授、钟南山院士和香港大学管轶教授用安徽省禽流感病人恢复期血清成功地救治了一位禽流感病人。2009年一月份中国各地相继发生多例人禽流感, 其中成功救治3例病人, 这3例病人都在发病的较早阶段使用了抗禽流感血清, 这些都提示抗禽流感抗血清/血浆对禽流感具有有效的保护作用。
3. 3. 2 单克隆抗体
近年来大量的文献资料显示, 不仅多克隆抗血清具有对禽流感的保护作用, 具有中和活性的单克隆抗体同样具有良好的保护作用。
[25]
P ra bhu 等用H 5N 1血凝素抗原HA 2的单克隆抗体1C9成功地保护了受致死剂量的病毒攻击的小鼠, 1C9对H5N 1病毒两个进化枝Clade 1和Clade 2具有交
[26]
叉保护活性。厦门大学夏宁邵教授的研究小组通过用不同H 5N1毒株依次免疫小鼠获得针对H 5N1病毒HA 抗原保守区(152、182位氨基酸) 的单克隆抗体13D4, 该单抗对禽流感病毒C la de 1、2. 1、2. 2和2. 3这4种进化枝均具有保护作用。Throsby 等人[27]和香港大学管轶教授研究团队利用抗体库技术从普通(季节性) 流感疫苗免疫的正常人Ig M +记忆B 细胞中筛选到一株单克隆抗体CR6261, 该人源抗体对于各种亚型禽流感(H1、H 2、H5、H6、H 8、H9) 包括H 5N1和H 1N1均具有很
[28]
好的保护作用。W ang 等人筛选到一株针对H 5N1
[23]
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M 2e 保守区的全人源抗体, 该单克隆抗体对攻毒动物也
具有良好的保护作用。4 结语
当前, 防止H 5N1禽流感病毒向人类传播的形势相当严峻, 新近出现的甲型H1N 1流感病毒再一次给人类敲响了警钟。由于禽流感病毒对离子通道抑制剂、神经氨酸酶抑制剂等化学药物的抗性, 新药或许会在新的抗病毒靶点和抗体制剂的研究中发现; 另外, 从种类庞大的抗生素中寻找新的抗禽流感病毒药物也是一条重要的途径。我们有理由相信随着医药基础理论的不断进展, 基因工程的不断发展以及对禽流感病毒的更进一步研究, 人禽流感完全可以做到早诊断、早治疗, 并且通过努力, 降低病死率, 而人类对禽流感的控制也会逐步实现。
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