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摘
纤维素酶活力测定方法
张瑞萍
南通工学院（２２６００７）
要用ＤＮＳ为显色剂，分别以滤纸和ＣＭＣ为底物，“滤纸糖酶括性（ＦＰＡ）和羧甲基纤维索酶活性（ＣＭＣｍ）表征
纤维索酶活力。确定酶括测定用波长为５３０ｎｍ．参比溶液应为失活酶、底物和ＤＮＳ等共热的反应物；比较了两种底物的酶
活力测定方法。结果表明，ＣＭＣ。。比ＦＰＡ高，说明酶对水溶性底物有较高的活力．也表明吸附对酶的括性部位与纤维索分子链段的结台及催化均有很大影响ｆ对于不同牌号的纤维素酶，织物的酶减量率与ＣＩＶＩＣ酶活力关系密切。
叙词；测试纤维素酶活磨中圈分类号：＂ＩＳｌ９７
Ｂ
纤维素酶是多组分复合物，各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同，致使纤维素酶活力测定方法很多，各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、ｃＭｃ为底物，原理系利用纤维素酶催化水解纤维素，产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖，与显色剂反应，求出还原糖的浓度，间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作ＦＰＡ（滤纸糖酶活力）和ＣＭＣ…（羧甲基纤维素酶酶活力）。本文分析确定酶活力测定的主要条件，比较两种底物的酶活力测定方法的结果，探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系，为酶在生产中的利用提供依据。
色化台物，用分光光度计比色，确定低分子糖含量。
碱性条件下ＤＮＳ与还原糖共热反应如下：
；≯—每＿ｃ。。Ｈ＋还原糖——；广每＿ｃ。。，Ｈ吼ＮＫＯＨ……糖一Ｈ”磁ＯＨ∞Ｈ
）一）一
０２Ｎ
Ｏ２Ｎ
ＤＮＳ（黄色）３－氨基一５一硝基水杨酸（棕红色）
生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。
２．２最大吸收波长的确定
选取４９０～５８０ｎｍ波长对显色液进行比色。由图ｌ可知，不同浓度的葡萄糖溶液在４９０～５００ｎｍ处有最大吸收，ＤＮＳ在此波长下也有较明显的吸收。为了排除ＤＮＳ的干扰，选择在波长５３０ｎｍ处进行测定，此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低，然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。
ｌ１ｌ４２
Ｏ
ｌ
实验方法
纤维素酶（工业品），ＤＮＳ试剂（自配），冰醋酸，醋
１．１化学药品、材料
酸钠，葡萄糖（均为分析纯），滤纸（定性），羧甲基纤维素酶ＣＭＣ（试剂级），纯棉针织物半制品（南通针织
厂）。
１．２
ｇ
０
０
８６
ｇ
ＦＰＡ滤纸酶活力和ＣＭＣ酶活力的测定
取适当稀释的酶液，分别以滤纸或１％的ＣＭＣ溶
０．４Ｏ
２
Ｏ
４９０
５１０
５３０
５５０
５７０
一剽矧验
５９０
液为底物，于５０℃恒温水解反应１ｈ；然后加人显色剂ＤＮＳ，沸水浴中煮沸５ｍｉｎ；再加入蒸馏水，于５３０测定吸光度ＯＤ值。
酶活可定义为：每毫升酶液１ｒａｉｎ产生ｌｍｇ葡萄糖为一个单位（“）。
１．３针织物酶减量率的测定
１１１１３．
波长’Ⅱｍ
图１ＤＮＳ与葡萄糖的吸收曲线
２．３底物殛酶本身含糖■的影响
在实验过程中发现，底物特别是滤纸，也含有一定的还原糖，在碱性的ＤＮＳ试剂中也会发色。而且，试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶，品种不同，其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰，参比溶液取失活后的酶、底物、ＤＮＳ等共热的反应物。２．４葡萄糖标准曲线
用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液，与ＤＮＳ共热反应显色后，测出其吸光度ＯＤ值（见图２）。标准曲线的线性相关系数Ｒ２为０．９９９１（见图２），线性相当好，可以用于酶活力的测定。
减量率一鲤趑箍黥獬严心。％
将酶处理前后的试样在烘箱中１０５℃烘至恒重。
２
结果与讨论
选用ＤＮＳ，在碱性条件下与还原糖反应，生成有
２．１显色剂的选择
３８
万方数据
２５
Ｅ０
ｇ５
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０
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Ｏ
５
图２葡萄糖标准曲线
２．５底物的选择对酶活力的影响
目前理论认为，大多数由微生物产生的纤维素酶是一个多组分酶系，主要含有三种组分：内切ｐｌ，４一葡聚糖酶、外切８１，４一葡聚糖酶和ｐ—ｌ，４葡萄糖苷酶。其中，内切（ｅｎｄｏ一）酶能进攻纤维素大分子链的中间部（”ｍ）酶仅从纤维索大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖；６－葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催
作为底物的滤纸其结构较为松散，可及区较多，非我们选择三种酸性纤维素酶，分别以滤纸和ＣＭＣ表１不同酶种的滤纸酶活（ＦＰＡ）和ＣＭＣ酶活（ＣＭＣ。。）
从表ｌ可知，ＣＭＣａｓｅ和ＦｐＡ两种酶活的大小顺Ｌ＞ＰＬＵＳＬ。这几种酶的内切用这几种酶对织物进行整理，织物的减量率与酶Ｌ：ＰＬＵＳＩ－
万
方数据一１：０．８７：０．７６），这与不同酶的ＣＭＣ。酶活比值（杰能科：ＮＯＶＯＬ：ＰＬＵＳＩ．一１：０．７９：Ｏ．６２）是牛Ｈ
近的。
醺用量．“
围３酶用量对减量率舯影响
从图ｓ看出，不同酶种在织物ｒ获得相同减量率表２不同酶种相同减■率的酶用量
单位；％（ｏｗｆ）
酶种
减量串．％
杰能科
ｏ６５２８１
７９７０
３１５７８４
ｇ４２４
ＮｏｖｏＬ０
８１１５
２．１０６７３７Ｉ６６６．１５６７
ＰＬＵＳＬ
】０２７２
２＋５６７８
４
６４０４
一
从表２知，织物减量率为１％、２％、３％、４％时Ｉ。＝（０．８３：
Ｉ。一（０．６７；１）。这与不同酶的
Ｉ。，ＰＬＵＳＬ一１：
从纤维素酶活ＣＭＣａｓｅ与织物的酶减量率和酶用结论
∞
（收稿日期：２００２—０３—１５）
位，任意地切断大分子，而生成较短的链；而外切２．７纤维素酶活与酶用量的关系
时的酶用量如表２所示。
化分解成葡萄糖。纤维素酶复台体与纤维素纤维作用的最终效果，是由其中各种酶综合作用所决定的。
还原性末端也较多，容易同时被内切酶和外切酶降解，再由ｐ葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖。用比色法定量测定还原糖的生成量，可反映纤维素酶的总酶活力。由于外切酶对纤维素链专一性高，而内切酶专一性较低，在降解羧甲基纤维素（ｃＭｃ）时，主要是反腱内
切酶的活力。
的酶用量比值平均为：杰能科：ＮＯＶＯＣＭＣ。。酶活比值（杰能科：ＮＯＶＯ０．７９：０．６２）也是一致的。
量的关系发现，织物的酶减量率与内切酶活（ＣＭＣ。）关系密切。所以，在实际生产中，使用不同牌号的纤维素酶时，制订处方要根据酶活力，特别是内切酶活力的大小，通过测定织物的整理效果来决定。３
１），杰能科：ＰＬＵＳ为底物，其酶括力（ＦＰＡ和ＣＭＣ…）的测试数据结果如
表ｌ所示。
序是：杰能科＞ＮＯＶＯ酶活（ＣＭＣ。）较高，且比总酶活（ＦＰＡ）大，几乎相差一个数量级，这说明酶对水溶性底物有很高的活力．而滤纸与酶属多相催化，酶也是高分子物，所以反应的空间阻碍较大，这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。２．６纤维素酶活与织物酶减量率的关系
种及酶量的关系如图３所示。从图３可看出，当三种酶的用量分别为２％、４％、６％、８％、ｌＯ％（ｏｗｆ）时，对应的减量率的比值平均（杰能科：ＮＯＶＯ
３．Ｉ试验表明，葡萄糖浓度与吸光度ＯＤ值的相关系数在０．９９９１，确定该标准曲线可用于酶活力测定。３．２确定ＤＮＳ为显色剂，酶活力测定用波长为５３０ｎｍ，参比溶液为失活酶、底物和ＤＮＳ等共热反应物。３．３底物不同，活力的测定值也不同。以援甲基纤维索为底物测得的酶活值ＣＭＣ，。比以滤纸为底物测得的酶活值ＦＰＡ高。这说明酶对水溶性底物有较高的活力，同时也表明，吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。
３．４对于不同牌号的纤维索酶，织物酶减量率与内切酶活（ＣＭＣａｓｅ）有密切的比例关系。