实验二 叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定
一、实验目的
掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCL
D：吸光度，即吸收光的量，
C：溶液浓度,
K：为比吸收系数（吸光系数），
L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 及类胡萝卜素分别在在 665nm 、649nm 和 470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材
仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇 材料：菠菜叶片
四、实验步骤
1、提取
称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱
去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm） 400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A
3、将色素提取液充分混匀后，取光径 1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长 665nm 、649nm 和 470nm 下测定吸光度（
4、结果计算
依据下列乙醇提取液中色素浓度计算公式，分别计算出叶绿素 a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
CT=Ca+Cb 、
和
）。
式中，
、
和
分别为叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度（mg/l）
; 为类胡萝卜素的总浓度（mg/l）
各叶绿体色素的含量
五、注意事项
1、每次改变波长后，要用95%乙醇重新调零。
2、用分光光度法测定物质含量时，分光光度计的波长调节要准确，参比杯与测定杯的透光率要一致。
附录：721型分光光度计的原理及使用方法
1.吸收光谱原理
物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。 当分子被光照射时，将吸收能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁波去激发。电子能级跃迁所需的能量较大，一般在1eV～20eV，吸收光谱主要处于紫外及可见光区，这种光谱称为紫外及可见光谱。如果用红外线(能量为1eV～0.025eV)照射分子，此能量不足以引起电子能级的跃迁，而只能引发振动能级和转动能级的跃迁，得到的光谱为红外光谱。若以能量更低的远红外线(0.025eV～0.003eV)照射分子，只能引起转动能级的跃迁，这种光谱称为远红外光谱。由于物质结构不同对上述各能级跃迁所需能量都不一样，因此对光的吸收也就不一样，各种物质都有各自的吸收光带，因而就可以对不同物质进行鉴定分析，这是光度法进行定性分析的基础。
根据朗伯—比耳定律:当入射光波长、溶质、溶剂以及溶液的温度一定时，溶液的光密度和溶液层厚度及溶液的浓度成正比，若液层的厚度一定，则溶液的光密度只与溶液的浓度有关，
式中，c为溶液浓度，E为某一单色波长下的光密度(又称吸光度)，I0为入射光强度，I为 透射光强度，T为透光率，ε为摩尔消光系数，l为液层厚度。
在待测物质的厚度l一定时，吸光度与被测物质的浓度成正比，这就是光度法定量分析的依据。
2.分光光度计的构造原理
将一束复合光通过分光系统，将其分成一系列波长的单色光，任意选取某一波长的光，根据被测物质对光的吸收强弱进行物质的测定分析，这种方法称为分光光度法，分光光度法所使用的仪器称为分光光度计。
分光光度计种类和型号较多，实验室常用的有72型、721型、752型等。各种型号的分光光度计的基本结构都相同，由如下五部分组成:
① 光源(钨灯、卤钨灯、氢弧灯、氘灯、汞灯、氙灯、激光光源)；
② 单色器(滤光片、棱镜、光栅、全息栅)；
③ 样品吸收池；
④ 检测系统(光电池、光电管、光电信增管)；
⑤信号指示系统(检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管)。
光源→单色器→样品吸收池→检测系统→信号指示系统
2.分光光度计的使用方法
在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
将仪器电源开通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的波长，然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度附近，仪器预热20分钟。
放大器灵敏度有五档，是逐步增加的，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后需按“4”重新校正“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
预热后，连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，当指针稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。