丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA微板法)
简介：
动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress) 时，会发生脂质氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA 在内的复杂化合物，此时通过检测MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA 的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA ，例如thromboxane synthase 也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。
丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA微板法，MDA Assay Kit) 又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒，是采用一种基于MDA 和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA 进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation) 水平检测，特别适用于微量样本的检测。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA 发生反应，形成红色的MDA-TBA 加合物，MDA-TBA 加合物在处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外，MDA-TBA 加合物也可以在被激发产生最大发射波长，据此也可以进行荧光检测。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
自备材料：
1、 生理盐水或PBS
2、 96孔板或离心管、小试管或 3、 酶标仪或分光光度计 4、 水浴锅或恒温箱 5、 离心机
操作步骤(仅供参考) ：
1、 样本处理：
①血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水稀释后检测。
②组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS 或Leagene Western及IP 细胞裂解液等进行匀浆或裂解。匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应适当；对于细胞，每106个细胞使用l 裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，离心，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜进行操作。样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA 含量。
2、 TBA 工作液的配制：称取适量TBA ，用TBA 稀释液配制成浓度为0的TBA 工作液。
例如取TBA 用TBA 稀释液配制，最终浓度即为的TBA 工作液。TBA 工作液需完全溶解后再使用，可以加热到促溶，并可通过反复剧烈Vortex 促溶。配制好的TBA 工作液4℃避光保存，至少3－4个月内有效。
3、 MDA 检测工作液的配制：临检测前，根据待测定的样品数(含对照) ，参考下表新鲜配
4、 稀释标准品：取适量标准品用恰当溶液稀释至1、2、5、10、20、50μM(如果进行简
易快速检测，标准品直接稀释10μM) 。注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS 获得时，标准品宜用相同溶液稀释。其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。配制好的MDA 标准品4℃避光保存，至少3－4个月内有效。 5、 样品测定:
①在离心管或其它适当容器内加入匀浆液、裂解液、PBS 、生理盐水等适当溶液作为空白对照(注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS 获得时，标准品宜用相同溶液稀释。其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性) 。加入上述不同浓度标准品用于制作标准曲线(如果进行简易快速检测，直接加入浓度为10μM 的标准品) ，加入样品用于测定；随后加入MDA 检测工作液。可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
②混匀, 加盖，水浴煮沸，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm 封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热的金属浴或者PCR 仪。 ③水浴或流水冷却至室温，离心。
④取上清，蒸馏水调零，用酶标仪检测吸光值，如果不方便测定吸光度，也可以测定之间的吸光度。
计算：
对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线) 计算；如果进行简易快速检测，直接以10μM 标准品进行计算) 获得MDA 的摩尔浓度，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA 含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA 含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。 简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA 含量计算公式：
MDA 浓度(μmol/L)=(OD测定-OD 空白)/(OD标准-OD 空白) ×10 简易快速细胞、组织样品中MDA 含量计算公式：
MDA 浓度(μmol//mg)=(OD测定-OD 空白)/(OD标准-OD 空白) ×10//蛋白质质量浓度(mg/ml) 式中：OD 测定=待测样品的吸光度值 OD 标准=标准品的吸光度值
OD 空白=空白对照的吸光度值
参考区间：
健康成年人血清MDA ：9.58±2.15μmol/L 健康成年人血浆MDA ：7.31±1.27μmol/L
注意事项：
1、 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
2、 参考取样量：血清、血浆、尿液取；低密度脂蛋白悬液取；食用油取；肝脏、心肌、
肌肉等，取匀浆。
3、 测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长，但应同时延长，以免造成批间差异。 4、 待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。 5、 避免使用EDTA 、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
有效期： 12个月有效。 相关：