黄酮提取工艺
2-1 微波辅助提取金银花总黄酮工艺流程图
3. 实验方法
3.1 标准曲线的制备
3.1.1最大吸收波长的选择方法
以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510nm处均有1个强吸收峰，因此选择510nm为测定波长。
3.1.2对照品溶液的制备方法
精密称取芦丁对照品10.2mg置50mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。
3.1.3 标准曲线的制备
精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在510nm处测定吸光度，以对照品量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3.2 微波提取单因素实验方法
分别考察不同的微波辐射功率,辐射时间,乙醇浓度,固液比对提取效果的影响
3.3 提取工艺正交试验设计方法
系统考察微波提取法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用微波辐射功率（A），辐射时间（B），乙醇浓度（C），固液比（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表设计，得到供试液。
3.4微波辅助提取法与乙醇回流法比较
比较两种提取方法的处理时间和液固比对总黄酮提取量的影响。传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低;而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮含量。
3.5总黄酮含量测定方法
取0.5mL液，加入5%亚硝酸溶液0.3mL荡摇匀，放置6min加入10%硝酸铝0.3mL荡摇匀，放置6min入4%氢氧化钠试液4mL，30%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min分光光度法，在510nm定吸光度值由标准曲线计算得总黄酮含量。 4. 结果
4.1 标准曲线绘制
表4-1 标准曲线表
编号 芦丁浓度（mg/mL） 吸光度（OD）
0 0
1 0.02
2 0.03
3 0.05
4 0.07
5 0.09
0 0.206 0.381
0.548 0.738 0.911
图4-1 标准曲线图
以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为：Y=10.328x+0.0147，R2=0.9900，表明在一定范围内线形关系良好。 4.2 微波提取金银花总黄酮单因素实验方法
4.2.1 微波功率对金银花总黄酮提取的影响
准确称取5g金银花粉末，加入70%的乙醇溶液，设定微波功率为126W-700W，微波辅助提取全程时间为10min，将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，检测总黄酮含量， 实验结果见图4-2和表4-2。
表4-2 微波功率对金银花总黄酮提取的影响
微波功率（W）
总黄酮得率（%）
126 1.34
252 1.86
406 2.05
567 2.43
700 2.10
图4-2 微波功率对金银花总黄酮提取的影响
由图4-2可知，微波功率设在300W~800W之间，随着微波功率的增大，微波对细胞壁的破碎作用增强，胞内总黄酮溶出速率增大，得率逐渐增高。
4.2.2 微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响
准确称取5g金银花粉末，加入适量70%的乙醇溶液，设定微波功率为406W，微波辅助提取时间分别设定为4min，6min，8min，10min，12min，14min将提
取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，检测总黄酮含量，实验结果见图4-2和表4-2。
表4-3 微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响
微波时间（min） 总黄酮得率
图4-3 微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响
4 1.26
6 1.54
8 1.76
10 2.48
12 2.36
由图4-3可见，微波时间在10min内，黄酮含量随着超声时间的延长而增加，10min时达到最大值。
4.2.3 固液比对金银花总黄酮提取的影响
准确称取5g金银花粉末，液固比分别设定为20，30，40，50，60将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，实验结果见图4-4表4-4。
表4-4 固液比对金银花总黄酮提取的影响
固液比（mL/g）
总黄酮得率（%）
20 1.58
30 2.16
40 2.20
50 1.98
60 1.76
图4-4 固液比对金银花总黄酮提取的影响
由图4-4可知，在液固比为1:30的时候有一个峰值，液固比在20到30时候随液固比的升高，含量增加，1:40到1:60的时候，随液固比的增加，含量减少。液固比在1:30的时候总黄酮含量最高，达到2.20%。
4.2.4 乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响
准确称取5g金银花粉末，加入适量70%的，设定微波功率为406W，微波辅助提取液固比设定为30,分别设定乙醇溶液溶度为50%，60%，70%，80%，90%将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2小时后合并提取液，检测总黄酮含量, 实验结果见图4.2.4表4.2.4.
表4-5 乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响
乙醇浓度（%）
50 60 70 80 90
总黄酮得率（%）
0.91 1.54 2.38 2.10 1.86
图4-5 乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响
从上图可见，金银花总黄酮最佳提取乙醇浓度为70%，而在乙醇浓度过高或过低时得率较小。可能的原因是：乙醇浓度过低，提取液中杂质含量较多，可能是蛋白质、过滤、浓缩、和分离均较困难;而随着乙醇浓度的提高，脂溶性的
物质溶出增多，给提纯带来较大的麻烦。所以，选择70%乙醇作为微波辅助提取溶剂。
4.3 微波辅助提取金银花总黄酮正交实验方法
为系统考察微波提取法的工艺参数，根据单因素实验，分别选择乙醇浓度%（A）、固液比（B）、微波功率W（C）和微波时间min（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用择 L9（34）正交表设计得
到供试液
正交设计表见4-6，实验结果见表4-7。
表4-6 正交实验因素水平表
实验号 乙醇浓度%（A） 固液比（B） 微波功率W（C） 微波时间min（D）
1 2 3
50 70 90
1:25 1:30 1:35
252 406 700
8 10 12
表4-7 微波辅助提取金银花总黄酮的L9（3）正交试验结果表
4
因素
乙醇浓度（%）
固液比（g/mL）
微波功率 （w）
微波时间 （min）
黄酮得率（%）
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M1 M2 M3
A 50 50 50 70 70 70 90 90 90 8.60 7.86 5.39
B 1:25 1:30 1:35 1:25 1:30 1:35 1:25 1:30 1:35 6.87 6.55 6.43
C 252 406 700 406 700 252 700 252
406 6.02
7.07 6.76
D 8 10 12 12 8 10 10 12 8 6.57 6.65 6.62
2.07 2.34 2.19 2.86 2.63 2.37 1.94 1.58 1.87
m1 m2 m3 R
2.87 2.62 1.80 1.07
2.29 2.18 2.14 0.15
2.01 2.36 2.25 0.25
2.19 2.217 2.207 0.027
为进一步确定各因素对金银花总黄酮得率的影响程度，对表4-7中的各因素进行方差分析和显著性检查，见表4-8。
表4-8 方差分析表
方差来源
离差平方和
自由度
均方
F值
显著性
A B C D
1.714 0.138 3.944 5.884
2 2 2 2
0.294 0.069 0.857 1.972
28.52 4.25 36.56 40.21
* * *
由上表可知：微波时间min（D）对提取率的影响很小，作为误差项。显著性检验后发现因素：固液比（B）、乙醇浓度%（A）和微波功率W（C）对指标影响显著。根据以上分析，可定出影响指标的因素显著性主次顺序为：ACBD。总黄酮的优选浸提条件（各因子优水平组合）为最佳提取功率为406W，最佳提取时间为12min，最佳固液比1:25，最佳乙醇浓度为70%。该工艺条件下金银花总黄酮粗品得率可以达到2.86%。