Pharmaceutical Biotechnology 2013，20（6）：557 559
药物生物技术
557
新型α-淀粉酶的研究进展
姚清，陈建华
*
（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）
摘要1，4糖苷键形成α-淀粉酶在食品、发酵、药品、纺织等行业有着广泛的用途。它能水解淀粉内部α-
小分子产物，例如葡萄糖、麦芽糖、低聚糖等。然而α-淀粉酶有一定的局限性，例如在较低pH 不能发挥高酶活。从极端微生物中寻找耐酸性和耐高温的α-淀粉酶以及对现有酶的改造成为近年来研究的热点。耐酸性和耐高温α-淀粉酶可以从真菌，细菌，古生菌获得。该文着重阐述通过分子生物学，定向进化技术及结构构造学去改善α-淀粉酶的性质，获得了很好的效果，并且满足了各种工业应用的需求。
关键词
α-淀粉酶；酸稳定；定点突变；定向进化
Q55
文献标志码
A
文章编号1005-8915（2013）06-0557-03
中，α-淀粉酶主要从芽孢杆菌属中获得。解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，脂肪嗜热芽孢杆菌在工业生产中认为是最好的α-淀粉酶生产菌株。现在人们着重研究耐热，耐盐淀粉酶的功能性质
［3］
中图分类号
淀粉来源丰富，在自然界中是含多聚糖最多的食物之一。淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉。水解淀粉能应用于食物、饮料、制药、纺织等行业。在19世纪以前，主要应用酸水解淀粉，而至今微生物α-淀粉酶水解淀粉已成功取代了化学降解法
［1］
，以便更有利于工业生产中
，酶水解优于酸水解是因为反应更具特异淀粉的降解过程并节省成本。目前，从脂肪嗜热芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌获取的耐热α-淀粉酶已经用于工业生产。生产淀粉酶的真菌一般是常温真菌，多为曲酶和青霉菌。曲霉是发酵工业和食品加工业的重要菌种，能高效分泌蛋白酶，淀粉酶，果胶酶等。米曲霉在工业上被认为是生产外源蛋白如α-淀粉酶的最好生产菌种。2
α-淀粉酶的基因克隆和表达
由于对α-淀粉酶易于进行筛选分析，并且容易获得负突变株，而且菌株的遗传背景清楚以及产α-淀粉酶的B . subtilis 发酵技术成熟，所以α-淀粉酶成为最早的应用于分子生物学研究的蛋白质之一
［4］
性，产物更具有稳定性以及需要较低的能量。而现代随着工业的需要，α-淀粉酶最具前景的性质是在酸性和高温的环境下仍然能够保持高的酶活，因此在艰苦的工业环境下，此类α-淀粉酶能保持高的活性使得它们在未来受到重视。
pH 6. 8，Ca 2+稳当代淀粉加工业中，α-淀粉酶在95ħ ，定的条件下发挥活性，而天然淀粉的pH 为3. 2 4. 5之间，所以为了适合α-淀粉酶的最适作用pH ，首先得将淀粉溶液
2+
的pH 提高到5. 8 6. 2，而且要添加Ca 去维持酶的稳定
性。这些步骤消耗了时间并增加了成本，所以对于耐酸性的α-淀粉酶的需求日益增加。同时热稳定性对于此类酶来说也是非常重要的特征，因为它能影响蛋白的主要结构。本综述主要讲述利用现代生物技术去改善α-淀粉酶的性质，从而更加适用于工业生产。1
α-淀粉酶的微生物来源
不同的α-淀粉酶来自于不同的植物，动物，微生物，而微生物正逐渐作为工业α-淀粉酶生产的重点。由于它们的生物多样性以及基因操作使得酶更易于积累，现在利用微生物发酵富集生产已经逐渐替代了传统从复杂真核细胞中提取α-淀粉酶
［2］
。Sajedi 等人克隆了
Bacillus sp . KＲ-8104的α-淀粉酶基因（1328bp ），该基因可以编码440氨基酸，在其C 端和N 端具有20个氨基酸的截断缺失。来源于B . acidicola 的α-淀粉酶基因被克隆进pET28a （+）载体中［5］，实现了在大肠杆菌中的表达，重组α-淀粉酶的相对分子质量是62ku ，其发挥活性的最适pH 为4. 0、最适温度是60ħ 。P . furiosus 来源的α-淀粉酶基因编码460个氨基酸，也实现了在大肠杆菌中的克隆表达，此酶发挥活性
2+
不依赖Ca ，其最适在98ħ 条件下活性可达3900U /mg，
。在原始菌株中，真菌来源的α-淀粉酶被pH 为5. 5 6. 0，98ħ 时的活性半衰期最适温度是100ħ ，为13h 。B . licheniformis NH 1的α的淀粉酶基因使用pDEST17表达系统也实现了大肠杆菌中的克隆与表达，所
发现比细菌来源的要更稳定。
α-淀粉酶可以从不同微生物来源中获得，在商业应用
**
11收稿日期：2013-05-06修回日期：2013-09-），E-mail ：yaoqing8856@163. com 。作者简介：姚清（1987-学生，研究方向：发酵工程，男，江苏镇江人，
），E-mail ：chenjh68@163. com 。教授，研究方向：分子生物学，男，江苏南京人，通讯作者：陈建华（1961-
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药物生物技术第20卷第6期
得到的重组α-淀粉酶与其野生型的α-淀粉酶相比在85ħ 时具有更强的热稳定性
［6］
改变热稳定性的突变主要位于结构域B 以及结构域B 和结Na-Ca ）和底物的结合点就在构域A 的交界处，而位点（Ca-此处
［15］
。来源于Aspergillus niger 的α-淀
粉酶具有酸稳定性，将其基因克隆到pPIC9K 载体在毕赤酵母中表达，可以达到很高的淀粉酶产量，约为2838U /mL。这种58ku 的重组α-淀粉酶的最适pH 为4. 0、最适温度为70ħ ［7］。3
α-淀粉酶结构构造学
圆二色谱和X 射线晶体衍射技术被广泛的应用于获得蛋白质的空间结构和构象方面的信息。α-淀粉酶含有3个结构域，一个中央的（α/β）
8
。Priyadharshini ［16］等人也曾报道称BLA 中钙结合
位点附近区域对于任何修饰也相当敏感。编码钙结合位点D 161，D 183，D 200和D 430）经定点突变为的氨基酸残基（N 104，
D 104，N 161，N 183，N 200和N 430，突变体蛋白在pH 5. 0和70ħ 下比活提高，而在30ħ 下活性降低。然而对N 104D 和D 430N 突变后并没有影响淀粉酶的稳定性。而D 161N 突变则显著的降低了淀粉酶的热稳定性。在另一项研究中，定点突变应用于来自于Bacillus megaterium WHO 的嗜温性α-淀粉酶
［17］
TIM-barrel （按磷酸丙糖异构酶
，来增强其热稳定性和钙离子独立性。在钙结合位点
命名，这个结构域由8个α-螺旋和8个平行的β-折叠交替组成），包含了3个位于结构域A 形成了分子的核心部分，E 261、D 328（按地衣芽孢杆菌α-活性位点的残基：D 231、淀粉酶（BLA ）编号），barrel 的两端。而结构域B 和C 则位于TIM-活性位点的氨基酸残基是十分保守的，当把嗜热芽孢杆菌α-淀粉酶（BStA ）和BLA 结构进行叠合时，发现部分催化残基存在一些结构上的变化
［8］
A 53S 突变体增强了的突变（A 53S 和H 58I ）会影响α-淀粉酶，钙结合能力很有可能导致了酶稳定性的增强。而且另外一个钙独立性突变体（H 58I ）具有很高的热稳定性。B . stearothermophilus α-淀粉酶中H 238D 的突变，参与钙离子和底物结合，该突变使得酶活性和热稳定性都降低。
有研究对BLA 进行一系列的替换去改善其在酸性pH 条件下的稳定性酶
［19］
［18］
。这些发现表明催化残基是柔
，并且获得了很好的效果。定点突变已
性的，这个性质在酶进行催化反应时十分重要。结构域B 是位于第三个α-螺旋和第三个β-折叠之间的突起部分，形成了一个不规则的类似于β-折叠的结构，这个结构可能是α-淀粉酶之间底物专一性和稳定性不同的主要原因。酶的C 末端序列位于结构域C ，此处包含一个希腊钥匙模体（是一个由4个毗邻的反平行β-片层组成，经常出现在蛋白结构中）。C-末端对酶与淀粉的结合以及酶的热稳定性都很重要
［9］
经用于改造多种酶的最适pH ，包括α-淀粉酶以及β-淀粉
［20］
，但是影响了酶的催化效率。Liu 等人描述了耐酸
性质和在两个关键碱基（L 134和S 320）发生突变的不同BLA 突变体的结构性质之间的关系。5
通过定向进化改善α-淀粉酶的性质
为了适应工业的一些特殊的要求，酶的催化性质必须要去修改。定向突变作为一种很有利的工具，去发现酶新的或改良的功能。定向进化被用来修饰许多酶的性质，例如酶的活性、选择性、稳定性及底物特异性组，交错延伸技术
［22］
［21］
。
［10］
众所周知α-淀粉酶都含有一个钙离子，位于结构域A 和结构域B 之间
，是酶的活性与稳定性所必需的。钙离
［11］
。定向进化
子的功能被证明仅仅只是结构性的，因为它离活性位点DNA 改组技术，包括很多技术，例如易错PCＲ，随机引发重
。现在淀粉加工业占据酶制剂的最大
市场，所以定向进化代替了天然进化，因为天然进化已经不适合工业应用的需要。Ｒichardson等人利用定向进化通过高通量筛选出两种具有优越性质并且适合工业加工的α-淀粉酶
［23］
的距离太远从而不能参与催化反应。许多结构中都有一个或更多的钙离子存在，其中第一个钙离子（CaI ）在所有α-淀粉酶中都是严格保守的，它连接结构域A 和B 帮助稳定活性位点的结构以及控制扩展的底物结合位点的构象。第二个钙离子（CaII ）位于CaI 附近，而且中间还有一个钠离Ca-Na-Ca 的这种排列在芽孢杆菌来源的α-子，淀粉酶中都普遍存在4
［12］
。籍PCＲ和DNA 改组技术通过高通量筛选可以
［24］
改善酶的性质，突变体有望将热稳定提高10ħ ，并且最适作用pH 为4. 5
。
α-淀粉酶作为最重要的工业酶之一，有着广泛的用途。随着α-淀粉酶应用范围的增加，研究更趋向于找到能耐热或pH 耐受的新型α-淀粉酶。在近代分子生物学和技术手段的不断创新下，人们可按照自己的需要去改造α-淀粉酶。利用新型的α-淀粉酶能简化淀粉的加工工艺，节约能量的消耗，降低加工陈本，增加生产效益，这对于我国的淀粉酶工业发展起着重要的作用。
参考文献
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。
定点突变改造α-淀粉酶
蛋白质的三维结构、化学修饰及其他方面的研究有助
于了解多种酶结构域的功能，进而为改造对催化活性相关的关键氨基酸以及在压力环境下提高酶的稳定性提供了指导。对于α-淀粉酶进行定点突变技术的研究，则是致力于改善水解酶来增加其热稳定性其产物特异性
［14］
［13］
，改变pH 活性范围以及
。
参与形成盐键、钙结合或潜在的脱酰胺过程的残基都能够影响蛋白的热稳定性，因此可以用于定点突变。能够
姚清，等：新型α-淀粉酶的研究进展
39：9099.
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YAO Qing ，CHEN Jian-hua *
（School of Life Science and Technology ，China Pharmaceutical University ，Nanjing 210009，China ）
Among a variety of amylolytic enzymes synthesized by microorganisms ，amylase has the largest application in food ，fer-α-mentation ，starch saccharification ，pharmaceutical ，textile industries and baking industries．The amylases hydrolyze the 1，4-glycosidic linkages in starch into dextrin ，maltose ，glucose and oligosaccharides．But the available α-amylases have several limitations ，such as
limited activity at low pH value ，so the study for acid-stable and thermostable amylases from extremophilic microorganisms and the engineering of the already available enzymes have been the major areas of research in this field over the years．The promising property of α-amylases is their activity at low pH value and high temperature．Acid-stable and thermostable α-amylases have been reported in fungi ，bacteria and archaea．This review focuses on the attempts that have been made in molecular biology ，directed evolution and structural conformation studies of α-amylases for improving their properties ，and the researches have made great progress of the amyl-ase to suit various industrial applications. Key words
Amylase ，Acid-stable ，Site directed mutagenesis ，Directed evolution α-Abstract