第４３卷第４期东北农业大学学报４３（４）：６２—６６２０１２年４月
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Ａｐｍ２０１２
水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析
赵书宇，刘海英，沈鹏，金正勋＋，张忠臣，张海彬，王露露
（东北农业大学农学院，哈尔滨１５帅３０）
摘要：为比较同一杂交组合不同直链淀粉舍量后代在灌浆期胚乳内蛋白表达差异。文章建立了一套适合灌浆期水稻胚乳蛋白的双向电泳技术，探讨了胚乳蛋白的提取、等电聚焦上样量的选择、胶务转移等双向电泳的一些关键技术。结果表明，一次溶解蛋白样品，ＴＣＡ一丙酮法优于酚法蛋白提取．３００斗ｇ上样量为最适上样量，能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像。
关键词：水稻；胚乳蛋白；双向电泳技术；优化中图分类号：Ｓ５１ｌ；Ｑ５ｌ
文献标志码：Ａ
文章编号：１００５－９３６９（２０１２）雌００６２—０５
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胚乳是水稻的主要食用部位，胚乳的形成和发进行室内分级筛选，并对耐低温资源绥农１４的子叶育直接影响着水稻的产量和品质“１。胚乳的主要成和真叶进行低温处理，利用２Ｄ技术寻找耐低温相
分是淀粉和蛋白质，因此，籽粒灌浆过程也是淀粉关蛋白。在绥农１４子叶处理试验中，处理与对照表
和蛋白质的合成与积累过程，在此过程中众多的酶达量相差３．５倍以上的蛋白质点共获得２９个，其中参与其中。有效地分离和鉴定灌浆过程中胚乳的蛋４℃处理上调表达有１３个点，下调表达蛋白质点白质对深入了解稻米品质形成的生化学机理具有十１６个ｍ。白月等用双向电泳技术分析水稻少侧根突
分重要的意义。近年来，迅速发展的蛋白质组学能变系ＭＴｌ０及其野生型ＩＲ８的根系全蛋白质组，建
使我们更深刻地了解蛋白质的功能及其相互调控立二者间的差异表达图谱，得到了１１个差异点，其机制，而且在逆境生理、杂种优势、品质研究中的中只在ＭＴｌＯ中表达的蛋白点有２个，只在ＩＲ８中表
应用也较广泛８Ｉ。单彩云对４７０份国内外大豆资源
达的蛋白点有４个，两者问有明显差异的蛋白点有
收稿日期：２０ｌｌ埘－０３
基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（Ｃ２０１００６）；东北农业大学创新团队发展计划项目（ｃｘＴ００ｌ—ｌ一２）
作者简介：赵书宇（１９８４．），男，硕｝．研究生．研究斤向为水稻蛋ｎ质组学研究。Ｅ—ｍｉｌ：Ｂｈｕ”小ａ０＠１２６．ｃｏｍ
＋通讯作者：金正勋，教授，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种和生物技术研究。Ｅ一——－“：ｚｘｊｉｎ３２６＠ｈｏｔｍｉｌ．ｃｏｍ
第４期赵书宇等：水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析
５个朋。刘文文等应用双向电泳（２一ＤＥ）技术分析了烯丙异噻唑诱导后水稻蛋白质的差异表达，在诱导４ｄ的双向电泳图谱上找到了ＩＯ个差异表达蛋白质点，选取其中３个进行质谱（ＭＡＬＤｌ－ＴＯＦ—ＭＳ）分析，分别具有泛醌一细胞色素ｃ还原酶、苏氨酸肽链内切酶和苹果酸脱氢酶活性１５１。
双向电泳技术是蛋白质组学的核心技术，它包括蛋白质的提取、纯化、等电聚焦和ｓＤｓ—ＰＡＧＥ电泳、凝胶染色、图像分析等技术ｍ，。其中蛋白质提取和上样量大小、胶条转移等对蛋白质分离效果影响很大。郝强等以北海道黄杨为模型植物，比较了ＴｃＡ／丙酮法、酚法和酚，ｓＤｓ法三种蛋白质提取方法，结果表明三种提取方法使得电泳结果相差很大，而改进的酚／ＳＤＳ法所得结果最好”ｌ。
本试验选用水稻抽穗后ｌＯｄ的籽粒，采用不同的蛋白质提取方法和上样量、胶条转移等对胚乳蛋白质进行分离效果比较分析，旨在建立适用于水稻胚乳蛋白质的双向电泳技术体系，为分离鉴定水稻胚乳蛋白质提供技术平台。
１
材料与方法
１．１材料
选用东农０８一１８稳定品系的直链淀粉含量不同的两个材料进行盆栽试验。盆规格为直径２５
ｃｍ，
高度３０ｃｍ，每盆４棵生长一致的秧苗，穴间距一致，每个材料重复３次，按常规方法进行肥水管理。抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后ｌＯｄ
取挂牌标记的５个穗，取穗中上部灌浆一致的籽
粒，剥去颖壳置于冻存管中一８０℃保存。１．２方法
１．２．１
水稻胚乳蛋白的提取
１．２．１．１
ＴＣＡ一丙酮法
取冻存籽粒２０粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵中迅速剥去种皮，切去胚，加ｏ．２％ＰＶＰ迅速研磨至糊状，悬浮于含Ｏ．昕％ＤＴＴ的预冷ｌｏ％ＴｃＡ一丙酮，一２０℃过夜。次日４℃３５
０００
ｒ・Ⅱｌｉｎ。１离
心１５ｍｉｎ，弃上清，将沉淀重悬于８０％丙酮，于一２０℃温浴ｌｈ，４℃１６
０００
ｒ・ｍｉｎ“离心１５
ｍｉｎ。
沉淀重悬于ｌｏｏ％丙酮，于一２０℃温浴ｌ
ｈ，４℃
１６０００
ｒ・ｍｉｎ“离心１５ｍｉｎ。重复此步骤２—４次，倒
出上清液，离心管置于冰浴中抽真空１５ｍｉｎ至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。
１．２．１．２酚法
参照易克等方法嘲，取冻存籽粒２０粒，加５倍体积提取缓冲液及０．５％ＰＶＰ。１２
ｏｏＯ
ｒ・ｍｉｎ。离心
１０
ｍｉｎ，取上清液。加入等体积的水饱和酚（ｐＨ
８．０），充分振荡，静置ｌＯｍｉｎ后，１２０００
ｒ・ｍｉｎ。离
心５ｍｉｎ。取酚相液体，加入５倍体积Ｏ．１ｍｏ卜Ｌ’１乙醇铵。置于一２０℃下３０ｍｉｎ，充分洗涤沉淀４次以上，除尽乙醇铵。冷冻抽干，所得干粉为租蛋白。１．２．２蛋白裂解及含量测定
用离心管称取３０ｍｇ粗蛋白干粉，向干粉中加人５００｜ＬＬ裂解缓冲液（８
ｍ０１・Ｌ～ｕｒｅａ，２ｍｏｌ・Ｌ＿１
ｔｈｉｏｕｒｅａ，４％ＣＨＡＰＳ，２．５％ｐＨ４～７ＩＰＧｂｕｆｆｅｒ，ｌ％
Ｄ’ｒｒ），３６℃温浴ｌｈ，离心时间取上清，其余两份作为该样品的霞复。采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白定量５・，以蛋白质裂解液为空白，１ｍｇ・ｍ一的牛血清白蛋白（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｍｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＡＳ）标准蛋白（标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制）为标准，在紫外一可见分光光度计下测定５９５ｎｍ的吸光值，绘制标准曲线，用于计算蛋白质样品的含量。１．２．３双向电泳
１．２３．１样品被动上样及等电聚焦
选用１７
ｃｍ
ＩＰＧ胶条（ｐＨ４—７）。ＩＰＧ干胶条胶
面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝ｈ后，置于Ｂｉｏ－Ｒａｄ等电聚焦仪中，等电聚焦在２０℃条件下自动进行，每胶条限流５０“Ａ。等电聚焦参数如下：
①５００
Ｖ４
ｈ除盐；
②ｌ０００Ｖｌ
ｈ线性上升（Ｇｍ）；③８０００Ｖ２．５ｈ线性上升（Ｇｒａ）；④８０００Ｖ
Ｏ．５
ｈ聚焦。
１．２．３．２胶条的平衡
将等电聚胶后的胶条胶面向上置于５ｍＬ平衡ｍｍｏ卜Ｌ＿１Ｔ＾ｓ—ＨＣＬ．ｐＨ８．８，６ｍｏ卜Ｌ－１
ｍｊｎ，然后再置于５ｍＬ平衡ｍｍｏｌ・Ｌ‘１Ｔｒｉｓ—ＨＣＬ，ｐＨ８．８，６ｍｏｌ・Ｌ‘１
ｍｉｎ，取出后放在湿润的定性１．２．３．３
ＳＤＳ—ＰＡＧＥ
采用Ｂｉｏ—Ｒａｄ垂直电泳系统，胶的浓度为
水．被动水化１４缓冲液Ｉ（５０
ｕｒｅａ，３０％甘油，２％ＳＤＳ，０．００２％溴酚蓝，１％ＤＴＴ）中平衡摇床震荡１５甥ｇ冲液Ⅱ（５０
ｕｒｅａ，３０％甘油，２％ｓＤｓ，０．００２％溴酚蓝，２．５％碘乙酰胺）中平衡１５滤纸上，以吸去表面多余的液体。
东北农业大学学报第４３卷
１２％．将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面上，用０５％的低熔点琼脂糖封顶液封闭排除气泡。在电泳槽中加人约１．５Ｌ电泳缓冲液
（Ｏ．０２５ｍｏ卜Ｌ。Ｔ—ｓ．０１９２ｍｏ卜Ｌ－‘Ｇｌｙｅｉｎｅ，０．１％
出，不同的蛋白质提取方法对双向电泳的分离效果有较大影响。使用ＰＤＯｕｅｓｔ分析软件对图１Ａ、Ｂ进行分析，图１Ａ共检测到蛋白点数（３２ｌ±５）个，图ｌＢ共检测到蛋白点数（１９５±５）个，而且ＴｃＡ一丙酮提取法的双向电泳结果清晰度明显好于酚法结果．酚法样品在等电聚焦过程中电压未能达到
８０００
ｓＤｓ）第一步每块胶１０ｍＡ下电泳３０ｍ衲，第二步每块胶２０ｍＡ下电泳至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘
０．５
ｃｍ时停止电泳。ｖ。这可能是由于酚法提取的蛋白样品会混
１．２ｊ．４考马斯亮蓝染色
有比较多的盐离子．影响了聚焦效果。２＿２不同上样量对胚乳蛋白分离效果的影响
上样量大小对电泳结果的清晰程度有很大的影响。上样量太小，低丰度蛋白就无法被识别；相反，如果上样量过大，虽然可以看到低丰度蛋白，但是会导致一些蛋白点过大而多点重合，为分析造成困难。图２中Ａ、Ｂ、ｃ分别是１００、３００、５００斗ｇ三种上样量的电泳结果。通过比较可
电泳后将凝胶立即放人固定液（４０％甲醇，ｌＯ％乙酸）中至少３０ｍｉｎ．可过夜；充分固定后用Ｍｉｌｌｉ—ｐｏｒｅ纯净水洗２次，每次５ｍＩｎ；换置考马斯亮蓝染液（１０％硫酸铰，１０％磷酸。２０％甲醇，ｎ０６％考马斯亮蓝Ｇ２５０染色，至少２ｈ；用脱色液（２５％乙醇，８％乙酸）脱去底色，或者直接用Ｍｍｉｐｏｒｅ纯净水脱色，直到蛋白点清晰为止。
２结果与分析
２．１不同提取方法对胚乳蛋白分离效果的影响
蛋白质样品制备是双向凝胶电泳最为关键的步骤之一。样品制备中关键为有效的去除淀粉等干扰成分，尽可能扩大其溶解度和解聚．尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失，以提高分辨率。图ｌＡ、Ｂ分别为利用ＴｃＡ一丙酮法和酚法提取蛋白质的电泳结果。通过比较图ｌＡ和Ｂ可以看
以看出，１００懈上样量的电泳图上共检测到蛋白
点数为（１０２土５）个，几乎看不到低丰度蛋白．而且其背景要深于图２Ｂ和ｃ；而５００¨ｇ上样量的电泳图上共检测到蛋白点数（３１０±５）个．有明显的横纹且横向分离效果不好，放大区域可以看到有些点
重合在一起。而３００她上样量的电泳图上共检测到蛋白点数（３３１±５）个，蛋白点数与５００嵋上样量
结果相差不多，但是图像清晰没有横纹和过大的蛋白点，便于分析。
毒
一≤专．箍．！ｊ
．１：■：
．‘÷艄一渔．：．誓
一■ｋ：ｉ
Ｂ
Ａ
Ａ—Ｔ℃＾一丙酮法：Ｂ－酚法
Ａ—ＴＣＡ一＾ｃｅｔｏｎｅ：Ｂ—Ｐｈｅｎｏｌ
围ｌ不同蛋白提取方法的双向电泳结果
Ｆｉｇ．１
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ｓＤＳ—ＰＡＧＥ这一过程同样是双向电泳的关键过程之一，主要涉及ＩＥＦ胶的同定和平衡以及包埋…。在
２＿３腔条的转移与封闭对胚乳蛋白分离效果的影响
等电聚焦完成后，将ＩＥＦ胶条转移到第二向
第４期
赵书宇等：水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析
・６５
这个过程中最容易出现胶条不平整和蛋白质扩散的问题，从而影响电泳的分辨率和准确度，应该加以精细的操作和调控。如图３所示，左边图中为包埋不平整的电泳图片，可以明显看出图中标出
区域中的蛋白点相对右边包埋较好的图片中同一区域的蛋白点位置发生了偏移，而且向中间聚集。影响了电泳图片的比对和分析。这可能是由于在加入封顶液时产生了较大的气泡造成的。
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・．—．－’：－１１＇ｒ
Ａ—１００％Ｂ＿３００Ｉ崤Ｃ一５∞Ｍ
圈２不同上样量的样品双向电津结果
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量较多。酚法虽然所得到的蛋白再溶性要好于ＴｃＡ一丙酮法。但是样品中混杂的盐离子等小分子杂质较多，使得等电聚焦不容易上升到设定的最高电压。当然这种影响可以通过多次溶解来去除．但是这样会损失一些低丰度蛋白，也有违提取操作尽量简单的原则。因此，综合考虑应该选择１℃Ａ一丙酮法。
ＴｃＡ一丙酮法所得的粗蛋白很多，但是再溶解性较差。在对粗蛋白用裂解液溶解的时候，可以用多个离心管同时溶解，离心取上清时合并同一样品，这样可以加大溶解效率，减小蛋白样品中
围３不同包埋效果的双向电泳结果比较
ｎ昏３‰ｐ丑一ｓ０Ⅱ０ｆｔ＿¨恤啪西呲ＩｇｅＩｅｌｅ咖晰醯时咖ｍｍｅｍ砌ｄｉｎｇ曲ｐ愀
３讨论与结论
３．１水稻胚乳蛋白的提取
蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学分析的关键步骤，蛋白样品的纯度和再溶性直接影响双向电泳（２一ＤＥ）分离结果的清晰度和重复性””。一般的蛋白质样品制备过程常采用丙酮、三氯乙酸或
硫酸铵进行沉淀…ｌ。本试验比较了代Ａ一丙酮法和
酚法提取水稻胚乳蛋白的双向电泳结果，发现利用ＴｃＡ一丙酮提取蛋白，不仅提取效率高，而且杂质干扰少，得到的电泳结果，蛋白条带清晰，数
・６６・
东北农业大学学报
第４３卷
不溶物的干扰。
提取的整个过程要在低温条件下进行，以防止蛋白被蛋白酶降解。由于要提取的是水稻籽粒的胚乳蛋白，为避免引入种皮和胚中蛋白的干扰，就要把种皮和胚完全去掉，这个过程要尽可能快速且在预冷的研钵中完成，所用的镊子和剪刀要灭菌预冷。由于操作精细，可以事先多加练习以加快操作速度。
３．２上样量的选择
上样量的选择是一个比较精细的工作，有的时候仅仅相差几十微克的上样量，所得到的电泳结果却相差很大。因此，需要在参考前人实验结果的同时，还应该对上样量进行多次试验和摸索．对结果进行多次比较，从而确定最佳上样量”“。本试验比
较了１００、３００、５００雌三种不同上样量的双向电
泳的结果，发现在上样量为３００斗ｇ时，得到最多的蛋白点数和背景清晰的电泳图。这是由于，在电泳槽中加入含有ｌｏｏ¨ｇ胚乳蛋白的水化液时，由于蛋白质含量较少，很多低丰度的蛋白虽然存在，却不能被分离出来。这样所得的图像就如图２Ａ所示，只有一些高丰度蛋白能被看到，而且背景相对要深一些。如果上样量达到过高，反而蛋白点要少，这是因为聚焦过程中蛋白质浓度过高而在胶槽中沉淀，不能很好地进入ＩＰＧ胶条中造成的””。
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水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
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东北农业大学学报
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