简述核酸疫苗制备过程
核酸疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，并激起机体一系列类似于疫苗接种的免疫应答；起到预防和治疗疾病的目的。自1990年Wolff 等人意外发现核酸疫苗后，其相关的研究得到了广泛的重视，并得以迅速发展，誉为“第三次疫苗革命”。本文就核酸疫苗的构建、特性、免疫机制、接种方式、影响因素、研究现状和前景作一综述。
一 核酸疫苗的构建
核酸疫苗是由编码病原体抗原的基因和作为真核细胞表达载体的质粒DNA 组成。病原体抗原的编码基因可以是一组相关基因或单一病原体免疫保护性抗原基因，也可以是编码抗原决定簇的一段DNA 序列，其表达产物应是病原体的有效成分，可以引发保护性免疫。用于构建核酸疫苗的载体质粒多以pUC 或pBR322质粒为基本骨架，主要包括启动子、增强子和3’端多聚A 。巨细胞病毒（CMV ）启动子和ROUS 肉瘤病毒（RSV ）的启动子都可在哺乳类细胞内表达。另外也有人采用来自哺乳动物和禽类的启动子。Fynan 等1993年将编码流感病毒血凝素H 或H7的CDNA 片段插入CMV 质粒的转录调控元件的下游，构建了抗流感病毒的核酸疫苗，另外，乙型肝炎病毒、人免疫缺陷综合症病毒、脑膜炎病毒等基因均被成功地克隆到含CMV 启动子的真核表达载体上，并表现了免疫活性。 用于构建核酸疫苗的病毒载体包括流感病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、脊髓灰质炎病毒等。1994年Castrucci-MR[6]把可以引起保护性免疫反应的致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）的表位基因片段克隆到流感病毒（H1N1）的基因组中制备核酸疫苗，免疫小鼠后，可使小鼠抵抗致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的攻击，其免疫效果可维持4个月以上。
二 核酸疫苗的特点
与传统的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下特点：
（1）免疫效果好，基因疫苗能在宿主细胞中产生外源性蛋白，此种蛋白比原核生物表达系统中产生的蛋白更象天然分子，其抗原识别递呈过程与自然感染十分相似，从而引起几乎等同于感染这些病原体或弱毒疫苗免疫后所产生的免疫应答，并且避免了基因重组技术在体外合成的蛋白质抗原表位丢失或改变。（2）利用一种表达载体同时表达多种蛋白，诱导机体产生针对多种病原体的免疫应答，从而起到一次注射核酸疫苗同时预防和治疗多种疾病的效果，并可抵抗某些变异病原体的侵袭（3）核酸疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内，可直接与MHC I类和MHC II类分子结合，引起广泛的细胞免疫和体液免疫，但无毒力返祖的危险（4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原表达，不与宿主染色体DNA 整合，但能在宿主体内表达，与病毒活疫苗相比，避免了病毒本身存在的复毒和病毒基因组整合到宿主染色体的危险（5）核酸疫苗具有共同的理化特性，可在同一载体上构建表达多种抗原，生产多价疫苗或同时注射2种以上的核酸疫苗来进行联合免疫（6）制备简单，利用成熟的基因重组技术，将克隆的目的基因DNA 直接接种，避免了表达载体的构建，表达产物的提取等繁琐过程（7）由于核酸疫苗作为重组质粒，能在工程菌内快速大量增殖，且提取方法简便，可使生产成本降低，并能加工干燥，便于储藏和运输。
三 核酸疫苗免疫机理
对核酸疫苗免疫机理说法不一，大多数学者认为，其致病机理在于他模拟了病毒的自然感染过程。DNA 质粒在注射部位被肌细胞吸收摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节合成所编码的蛋白质，合成的蛋白质被细胞内蛋白酶复合体降解成含病毒抗原表位的肽段，进入内质网与合成MHCI 类分子结合，然后被转运系统递呈到细胞膜表面，此复合体共同激活CD8+CTL，部分被分泌或释放入血的蛋白质，激活特异性B 细胞，从而产生保护性抗体；另外，分泌的蛋白质被巨噬细胞或树突状细胞等专职抗原递呈细胞俘获，被加工成肽段，进入溶酶体/内体区与MHC II类分子结合，激活受MHC II类分子限制的CD4+Th细胞，被激活的Th 细胞分泌IFN —γ、IL-2等细胞因子，，进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫。另外，试验证明质粒上的氨苄青霉素抗性选择基因中的回文结构5’-AACGTT-3’能够使单核细胞产生白细胞介素-12，刺激细胞分泌干扰素，增强NK 细胞的活性，称为“单链免疫刺激DNA 序列”起到佐剂的作用。
四 核酸疫苗的接种方式
核酸疫苗可以通过多种方式、途径接种到机体的适当部位，不同的接种方式或途径可影响其免疫效果。接种途径依启动子的来源而有所区别，用动物病毒和一般哺乳动物启动子构建的DNA 疫苗一般用生理盐水稀释质粒DNA 肌肉注射法，如股四头肌和腓肠肌等骨骼肌因为其特殊结构如肌浆网、横向微管系统，适合于摄取和表达DNA ，兼之其注射方便，因而常被选为接种组织，也可选择肌肉皮下、腹腔内、静脉内接种。而用来自乳腺的乳清酸蛋白（WAP ）启动子构建的疫苗在乳腺和皮下脂肪接种效果更好；也有鼻腔内滴鼻法进行黏膜吸附免疫接种。第二种方法是用高速度来提高疫苗DNA 对组织的转染率和表达效率，一般用特殊工具-基因枪接种，基因枪能将包裹在金粒上的质粒DNA 直接注射进表皮细胞。用基因枪接种比直接注射核酸疫苗的免疫效果好60-600倍。用基因枪接种只需0.4-0.004µg 纯化DNA ，而肌肉注射需100-200µg 的核酸疫苗，才能获得很明显的免疫效果。Fynan[2]等人进行了不同方式接种流感病毒核酸疫苗免疫效力的研究证明上述二者的接种效果均高于静脉、鼻腔、真皮、皮下等其它接种方式，但不同宿主细胞所产生的免疫接种效果并不完全一致。第三种方法是将组织预先用药物如丁哌卡因、心肌毒素和高渗蔗糖等处理，增加组织细胞对疫苗DNA 的摄取和表达能力，称为“药物协助法” 。另有人将疫苗DNA 与粒细胞、巨噬集落刺激因子表达载体或一些细胞因子等一起或分别注射均能明显的提高疫苗免疫效率。还有用腺病毒介导或脂质体介导注射方法的报道，但存在潜在癌基因激活及缺乏细胞的导向性等缺点。
五 核酸疫苗免疫效果的影响因素
（1）表达载体对核酸疫苗的影响
表达载体对核酸疫苗的效力有很大的影响，表达载体主要以pUC 和pBR322质粒为基本骨架，含DNA 复制起始点、抗生素抗性基因、启动子、增强子和3’多聚A 终止信号等结构，能在大肠杆菌中稳定地复制，但不能在哺乳动物细胞中复制。其中控制外源基因表达的启动子对载体的影响最大。启动子因来源不同有组织特异性，并且在各种组织中起始mRNA 合成的效能也不同。基因疫苗中常用的来自病毒的启动子包括猴病毒40（SV40）早期启动子、巨细胞病毒（CMV ）
早期启动子及罗斯肉瘤病毒（RSV ）启动子等，这些启动子的组织特异性较广，在许多组织细胞中能较好地表 达外源基因，且在肌肉组织中的表达效率最高。Davis 等曾将HBSAG 基因分别克隆到含CMV 和RSV 启动子的质粒载体上，注射实验动物后，发现含CMV 启动子的质粒诱导的免疫反应明显强于后者。现在大多采用CMV 启动子。也有人用来自哺乳动物和禽类的启动子如人β-肌动蛋白启动子、乳清酸蛋白（WAP ）启动子、绵羊金属硫蛋白启动子和鸡β-肌动蛋白启动子[20-21]等构建基因疫苗。这些启动子在肌肉内都有较好的转录活性，而WAP 启动子则在乳腺和皮下脂肪表达效率最高。另外，Danko 等[22]报告，共价闭环型的质粒pRSVL DNA的表达效率远高于线性质粒pRSVL DNA。
(2) DNA 输入组织的方式
DNA 输入组织可以用注射、脂质体包裹后注射、基因枪轰击、口服等。其免疫效果因注射速度、导入速度、免疫剂量、接种部位、及宿主细胞不同而各有差异。另外肌肉注射前用蛇毒、心肌毒素、高渗蔗糖（25%W/V，用PBS 溶解）、丁哌卡因等预处理，可显著提高外源基因的表达。
(3) 佐剂；Arom 、QSI 、细胞因子如IL-2等均可改变或提高核酸疫苗的免疫效力。
(4) 机体免疫反应：由于核酸疫苗导入体内加工后表达既可激活CD8+TCL细胞，引起细胞免疫，表现出外周血淋巴细胞增殖反应增强、白细胞介素2、γ干扰素分泌增加、细胞毒T 淋巴细胞反应增强等表现。又能通过分泌抗原表达，激活TH 细胞或直接激活B 淋巴细胞产生抗体，故笔者认为机体免疫机能状态也是影响其免疫效力的主要原因之一。
六 核酸疫苗的研究现状及应用前景
自从90年核酸疫苗诞生之日起，学者们先后将一些不同病原体抗原基因的质粒DNA 克隆到适宜的真核表达载体中，并接种于相应的动物体内，引发了特异性的免疫应答，对野毒株的攻击具有保护作用，以达到预防和治疗疾病的目的。目前，许多种细菌、病毒、寄生虫的核酸疫苗得到了广泛的应用，并取得了良好的临床保护效果。 Ulmer 等（1993）首先报道将流感病毒高度保守的核蛋白（NP ）的cDNA 克隆于质粒载体中，构建成表达NP 的核酸疫苗，取适量注入小鼠的股四头肌，诱导出抗NP 的特异性IgG 抗体和CTL 应答。由于保护性抗原基因非常保守，故免疫小鼠即可抗同株流感病毒攻击，又可抵抗异株流感病毒攻击。爱滋病自本世纪80年代初发现以来，呈逐年成倍增长的趋势，其高度的致死性与惊人的蔓延速度令人“谈艾色变”，因此在世界范围内急需一种安全有效的HIV 疫苗问世。HIV 中和抗原gp120V3区序列存在一高度同源共有序列，以此作疫苗研制的靶抗原可能会扩大疫苗的免疫保护范围。目前有关HIV 外壳糖蛋白的基因重组疫苗、合成肽疫苗、重组病毒活载体苗正在积极研制中，但仍未取得另人满意的的结果。1993年美国的WANG 等率先应用DNA 疫苗技术将编码HIV-1包膜糖蛋白基因cDNA 重组质粒pM160接种小鼠，产生了抗HIV-1包膜糖蛋白的特异性抗体，此抗体能中和HIV-1对体外培养细胞的感染，抑制HIV-1介导的体外培养细胞的合胞体的形成；并且还观察到了特异性的T 细胞增殖现象；同时他们通过小鼠、猴体内进一步实验发现，若在DNA 注射前对局部肌肉用药物预处理能明显提高了动物机体 对HIV-1包膜糖蛋白的免疫应答能力，并检测到了特异的CTL 应答。1994年Davis 等分别将乙型肝炎表面抗原基因插入到了带CMV 启动子的质粒构建了DNA 疫苗，并肌肉注射小鼠体内，证明可在体内产生类似于病毒感染的细胞和体液免疫应答。Davis 等研究人员证明注射部位药物
预处理后，可产生更强大的免疫效力。同时证明使用无针生物注射器（Bioinjector ）可将重组疫苗导入肌肉组织中，也能诱导对HBsAg 的体液免疫反应。国内亦有对HBV 核酸疫苗研究的报道。此外，针对人类病原微生物的核酸疫苗还包括HEV[28]狂犬病病毒[11]单纯疱疹病毒结核病多种寄生虫LCMV[5]等。我们也构建了编码猪冠状病毒（TGEV ）的主要抗原位点和完整刺突 (Spike, S) 基因的真核表达质粒，并检测到了体内和体外的表达。
七 核酸疫苗的安全性问题
核酸疫苗的性质介于传代细胞系生产的生物治疗剂与基因产品之间。由外源基因导入引起的内源性致癌基因的插入性激活和抑癌基因插入性激活的可能性往往被忽略，但核酸疫苗本质主要为外源DNA ，并且目前构建的DNA 载体来看，大都含有某些致癌病毒的DNA 序列，如CMV 、RSV 的启动子序列。虽然通过对1800余中核酸疫苗的检查没有发现导入基因和宿主染色体DNA 整合的证据，但核酸疫苗在应用于人体之前，这个问题须明确解决。目前对于抗DNA 抗体的产生有两种假设：1是由B 淋巴细胞增生产生2由抗原DNA 引起B 淋巴细胞活化和选择产生，而抗DNA 抗体的出现必然会诱发新的疾病。核酸疫苗注射机体后可长期在体内表达外源抗原，一方面，核酸疫苗表达的抗原在新环境中可能诱导不适当的免疫应答，甚至在长期表达状态下诱导免疫耐受；另一方面，如果免疫应答过程中有可能出现过度刺激并产生交叉免疫反应性，后者在严重情况下导致自身免疫病的产生亦可发生超敏反应。尽管这些推测尚属假设，但仍具有可能性，一旦出现上述情况，很难逆转，必须予以重视。现阶段疫苗的研制开发正处于探索阶段，各实验室所用的动物、表达载体、基因片段、免疫途径等尚无统一标准，导致实验结果差异较大，安全性不能得到充分保证，因此有必要根据不同病原体等实际情况制定一套规范的准则，使核酸疫苗的制备和应用有规可循，从而最大限度地保证其安全性。人用核酸疫苗在应用人体实验前、中、后过程中，要使受试者充分认识核酸疫苗的优点和其存在的问题，包括近期和远期的潜在可能危险性，并做定期的包括肿瘤、 抗DNA 抗体、自身免疫疾病等方面的检查，尽可能地做到使受试者放心。而在目前兽类传染病核酸疫苗的研制明显落后于人类传染病核酸疫苗研制的前提下，核酸疫苗技术应该引起兽医工作者更广泛的关注，并致力与兽类传染病核酸疫苗的研究。另外，由于非种畜禽生产周期短、不需要考虑伦理问题等特点，使得兽类传染病核酸疫苗比人类传染病核酸疫苗的推广应用可能更为容易。